A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد وتحليل المصب لعضويات الدماغ البشري باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة.

Abstract

على مدى العقد الماضي ، تطورت النسخ أحادية الخلية بشكل كبير وأصبحت طريقة مختبرية قياسية للتحليل المتزامن لملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الفردية ، مما يسمح بالتقاط التنوع الخلوي. من أجل التغلب على القيود التي تفرضها أنواع الخلايا التي يصعب عزلها ، يمكن استخدام نهج بديل يهدف إلى استعادة النوى المفردة بدلا من الخلايا السليمة للتسلسل ، مما يجعل التنميط النسخي للخلايا الفردية قابلا للتطبيق عالميا. أصبحت هذه التقنيات حجر الزاوية في دراسة عضويات الدماغ ، وتأسيسها كنماذج للدماغ البشري النامي. من خلال الاستفادة من إمكانات النسخ أحادية الخلية والنواة المفردة في أبحاث الأعضاء في الدماغ ، يقدم هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة يشمل الإجراءات الرئيسية مثل تفكك الأعضاء ، وعزل الخلية الواحدة أو النوى ، وإعداد المكتبة والتسلسل. من خلال تنفيذ هذه الأساليب البديلة ، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات بيانات عالية الجودة ، مما يتيح تحديد أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية ، وملامح التعبير الجيني ، ومسارات نسب الخلايا. هذا يسهل التحقيقات الشاملة في العمليات الخلوية والآليات الجزيئية التي تشكل نمو الدماغ.

Introduction

على مدى السنوات الماضية ، ظهرت تقنيات الأعضاء كأداة واعدة لزراعة الأنسجة الشبيهةبالأعضاء 1،2،3. خاصة بالنسبة للأعضاء التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل الدماغ البشري ، توفر الكائنات العضوية الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التطور ومظاهر المرض4. على هذا النحو ، تم استخدام عضويات الدماغ على نطاق واسع كنموذج تجريبي للتحقيق في اضطرابات الدماغ البشرية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنموية أو النفسية أو حتى الأمراض التنكسية العصبية4،5،6.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول الموصوف في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 1 التابع لمركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي (رقم الموافقة: 138/08) ، وفقا للمتطلبات وامتثالا لقواعد الاتحاد الأوروبي والقواعد الوطنية بشأن الأخلاقيات في البحث.

1. اشتقاق عضويات الدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لعدة خطوط iPSC مختلفة مستزرعة في مجموعة متنوعة من وسائط الخلايا الجذعية من شركات مختلفة (الجدول 1). يعتمد توليد عضويات الدماغ الأمامي بشكل كبير على iPSCs عالية الجودة والتقاء 60٪ -70٪ قبل بدء البروتوكول. هنا استخدمنا خط خلية متاح تجاريا (انظر

النتائج

للتحقيق في تكوين نوع الخلية من عضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq و snRNA-seq ، تم حصاد عضويات الدماغ بعد 30 يوما من الثقافة حيث تظهر الكائنات العضوية في هذه المرحلة بالفعل حلقات ظهارية عصبية تتكون من أسلاف محاطة بأسلاف وسيطة وخلايا عصبية في مرحلة مبكرة 4,18. تعد مراقبة ?.......

Discussion

برز التحليل النسخي للخلايا المفردة والنوى المفردة كأداة محورية لفهم الآليات التنظيمية الجينية داخل الأنسجة المعقدة. كلتا الطريقتين تمكن من دراسات النسخ من عضويات الدماغ. لضمان تجربة ناجحة بشكل عام ، تكون جودة المواد الأولية ذات أهمية عالية. لذلك ، من الضروري قطع المواد العضوية بانتظام ل?.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر فاليريا فرنانديز فالون على التعليمات الأصلية لمجموعة Miltenyi Neural Disdisation. نشكر أيضا منصة تكنولوجيا الجينوم الخاصة ب Max Delbrueck Centrum على توفير وصفة المخزن المؤقت للتحلل NP40 والمشورة القيمة لإعداد هذا البروتوكول. كما نشكر مارغريتا هيرتسوغ وألكسندرا تشيرنيشيف على الدعم التنظيمي للمختبر.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

References

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved