A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد وتحليل المصب لعضويات الدماغ البشري باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة.
على مدى العقد الماضي ، تطورت النسخ أحادية الخلية بشكل كبير وأصبحت طريقة مختبرية قياسية للتحليل المتزامن لملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الفردية ، مما يسمح بالتقاط التنوع الخلوي. من أجل التغلب على القيود التي تفرضها أنواع الخلايا التي يصعب عزلها ، يمكن استخدام نهج بديل يهدف إلى استعادة النوى المفردة بدلا من الخلايا السليمة للتسلسل ، مما يجعل التنميط النسخي للخلايا الفردية قابلا للتطبيق عالميا. أصبحت هذه التقنيات حجر الزاوية في دراسة عضويات الدماغ ، وتأسيسها كنماذج للدماغ البشري النامي. من خلال الاستفادة من إمكانات النسخ أحادية الخلية والنواة المفردة في أبحاث الأعضاء في الدماغ ، يقدم هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة يشمل الإجراءات الرئيسية مثل تفكك الأعضاء ، وعزل الخلية الواحدة أو النوى ، وإعداد المكتبة والتسلسل. من خلال تنفيذ هذه الأساليب البديلة ، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات بيانات عالية الجودة ، مما يتيح تحديد أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية ، وملامح التعبير الجيني ، ومسارات نسب الخلايا. هذا يسهل التحقيقات الشاملة في العمليات الخلوية والآليات الجزيئية التي تشكل نمو الدماغ.
على مدى السنوات الماضية ، ظهرت تقنيات الأعضاء كأداة واعدة لزراعة الأنسجة الشبيهةبالأعضاء 1،2،3. خاصة بالنسبة للأعضاء التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل الدماغ البشري ، توفر الكائنات العضوية الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التطور ومظاهر المرض4. على هذا النحو ، تم استخدام عضويات الدماغ على نطاق واسع كنموذج تجريبي للتحقيق في اضطرابات الدماغ البشرية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنموية أو النفسية أو حتى الأمراض التنكسية العصبية4،5،6.
يتم تنفيذ البروتوكول الموصوف في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 1 التابع لمركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي (رقم الموافقة: 138/08) ، وفقا للمتطلبات وامتثالا لقواعد الاتحاد الأوروبي والقواعد الوطنية بشأن الأخلاقيات في البحث.
1. اشتقاق عضويات الدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)
ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لعدة خطوط iPSC مختلفة مستزرعة في مجموعة متنوعة من وسائط الخلايا الجذعية من شركات مختلفة (الجدول 1). يعتمد توليد عضويات الدماغ الأمامي بشكل كبير على iPSCs عالية الجودة والتقاء 60٪ -70٪ قبل بدء البروتوكول. هنا استخدمنا خط خلية متاح تجاريا (انظر
للتحقيق في تكوين نوع الخلية من عضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq و snRNA-seq ، تم حصاد عضويات الدماغ بعد 30 يوما من الثقافة حيث تظهر الكائنات العضوية في هذه المرحلة بالفعل حلقات ظهارية عصبية تتكون من أسلاف محاطة بأسلاف وسيطة وخلايا عصبية في مرحلة مبكرة 4,18. تعد مراقبة ?.......
برز التحليل النسخي للخلايا المفردة والنوى المفردة كأداة محورية لفهم الآليات التنظيمية الجينية داخل الأنسجة المعقدة. كلتا الطريقتين تمكن من دراسات النسخ من عضويات الدماغ. لضمان تجربة ناجحة بشكل عام ، تكون جودة المواد الأولية ذات أهمية عالية. لذلك ، من الضروري قطع المواد العضوية بانتظام ل?.......
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
نشكر فاليريا فرنانديز فالون على التعليمات الأصلية لمجموعة Miltenyi Neural Disdisation. نشكر أيضا منصة تكنولوجيا الجينوم الخاصة ب Max Delbrueck Centrum على توفير وصفة المخزن المؤقت للتحلل NP40 والمشورة القيمة لإعداد هذا البروتوكول. كما نشكر مارغريتا هيرتسوغ وألكسندرا تشيرنيشيف على الدعم التنظيمي للمختبر.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
cAMP | Biogems | 6099240 | |
cAMP | Biogems | 6099240 | |
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
PenStrep (Penicillin - Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved