توليد وتحليل المصب للنسخ أحادي الخلية وأحادي النوى في عضويات الدماغ

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد وتحليل المصب لعضويات الدماغ البشري باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة.

Abstract

على مدى العقد الماضي ، تطورت النسخ أحادية الخلية بشكل كبير وأصبحت طريقة مختبرية قياسية للتحليل المتزامن لملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الفردية ، مما يسمح بالتقاط التنوع الخلوي. من أجل التغلب على القيود التي تفرضها أنواع الخلايا التي يصعب عزلها ، يمكن استخدام نهج بديل يهدف إلى استعادة النوى المفردة بدلا من الخلايا السليمة للتسلسل ، مما يجعل التنميط النسخي للخلايا الفردية قابلا للتطبيق عالميا. أصبحت هذه التقنيات حجر الزاوية في دراسة عضويات الدماغ ، وتأسيسها كنماذج للدماغ البشري النامي. من خلال الاستفادة من إمكانات النسخ أحادية الخلية والنواة المفردة في أبحاث الأعضاء في الدماغ ، يقدم هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة يشمل الإجراءات الرئيسية مثل تفكك الأعضاء ، وعزل الخلية الواحدة أو النوى ، وإعداد المكتبة والتسلسل. من خلال تنفيذ هذه الأساليب البديلة ، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات بيانات عالية الجودة ، مما يتيح تحديد أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية ، وملامح التعبير الجيني ، ومسارات نسب الخلايا. هذا يسهل التحقيقات الشاملة في العمليات الخلوية والآليات الجزيئية التي تشكل نمو الدماغ.

Introduction

على مدى السنوات الماضية ، ظهرت تقنيات الأعضاء كأداة واعدة لزراعة الأنسجة الشبيهة^{بالأعضاء 1،2،3}. خاصة بالنسبة للأعضاء التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل الدماغ البشري ، توفر الكائنات العضوية الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التطور ومظاهر المرض⁴. على هذا النحو ، تم استخدام عضويات الدماغ على نطاق واسع كنموذج تجريبي للتحقيق في اضطرابات الدماغ البشرية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنموية أو النفسية أو حتى الأمراض التنكسية العصبية^4،5،6.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول الموصوف في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 1 التابع لمركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي (رقم الموافقة: 138/08) ، وفقا للمتطلبات وامتثالا لقواعد الاتحاد الأوروبي والقواعد الوطنية بشأن الأخلاقيات في البحث.

1. اشتقاق عضويات الدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لعدة خطوط iPSC مختلفة مستزرعة في مجموعة متنوعة من وسائط الخلايا الجذعية من شركات مختلفة (الجدول 1). يعتمد توليد عضويات الدماغ الأمامي بشكل كبير على iPSCs عالية الجودة والتقاء 60٪ -70٪ قبل بدء البروتوكول. هنا استخدمنا خط خلية متاح تجاريا (انظر

النتائج

للتحقيق في تكوين نوع الخلية من عضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq و snRNA-seq ، تم حصاد عضويات الدماغ بعد 30 يوما من الثقافة حيث تظهر الكائنات العضوية في هذه المرحلة بالفعل حلقات ظهارية عصبية تتكون من أسلاف محاطة بأسلاف وسيطة وخلايا عصبية في مرحلة مبكرة ^4,18. تعد مراقبة ?.......

Discussion

برز التحليل النسخي للخلايا المفردة والنوى المفردة كأداة محورية لفهم الآليات التنظيمية الجينية داخل الأنسجة المعقدة. كلتا الطريقتين تمكن من دراسات النسخ من عضويات الدماغ. لضمان تجربة ناجحة بشكل عام ، تكون جودة المواد الأولية ذات أهمية عالية. لذلك ، من الضروري قطع المواد العضوية بانتظام ل?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005