Beyin Organoidlerinde Tek Hücreli ve Tek Çekirdekli Transkriptomların Oluşumu ve Aşağı Akış Analizi

Özet

Burada, tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizilimi kullanarak insan beyni organoidlerinin üretilmesi ve aşağı akış analizi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Son on yılda, tek hücreli transkriptomik, tek tek hücrelerin gen ekspresyon profillerinin eşzamanlı analizi için önemli ölçüde gelişti ve hücresel çeşitliliğin yakalanmasına izin vererek standart bir laboratuvar yöntemi haline geldi. İzole edilmesi zor hücre tiplerinin getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, dizileme için sağlam hücreler yerine tek çekirdekleri geri kazanmayı amaçlayan alternatif bir yaklaşım kullanılabilir ve bu da tek tek hücrelerin transkriptom profillemesini evrensel olarak uygulanabilir hale getirir. Bu teknikler, beyin organoidlerinin incelenmesinde bir mihenk taşı haline geldi ve onları gelişmekte olan insan beyninin modelleri haline getirdi. Beyin organoid araştırmalarında tek hücreli ve tek çekirdekli transkriptomiklerin potansiyelinden yararlanan bu protokol, organoid ayrışma, tek hücreli veya çekirdek izolasyonu, kütüphane hazırlama ve dizileme gibi temel prosedürleri kapsayan adım adım bir kılavuz sunar. Araştırmacılar, bu alternatif yaklaşımları uygulayarak, nöronal ve nöronal olmayan hücre tiplerinin, gen ekspresyon profillerinin ve hücre soy yörüngelerinin tanımlanmasını sağlayan yüksek kaliteli veri kümeleri elde edebilirler. Bu, beyin gelişimini şekillendiren hücresel süreçler ve moleküler mekanizmalar hakkında kapsamlı araştırmaları kolaylaştırır.

Giriş

Son yıllarda, organoid teknolojileri, organ benzeri dokuları kültürlemek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkmıştır ^1,2,3. Özellikle insan beyni gibi kolayca erişilemeyen organlar için organoidler, gelişim ve hastalık tezahürü hakkında bilgi edinme fırsatı sunar⁴. Bu nedenle, beyin organoidleri, gelişimsel, psikiyatrik ve hatta nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli insan beyni bozukluklarını araştırmak için deneysel bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ^4,5,6

Protokol

Açıklanan protokol, Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'nin (onay numarası: 138/08) biyogüvenlik seviye 1 laboratuvarında, gerekliliklere uygun olarak ve araştırma etiğine ilişkin AB ve ulusal kurallara uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Ön beyin organoidlerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilmesi

NOT: Bu protokol, farklı şirketlerden çeşitli kök hücre ortamlarında kültürlenen birkaç farklı iPSC hattı için test edilmiştir (Tablo 1). Ön beyin organoidlerinin üretimi, yüksek kaliteli iPSC'lere ve protokole başlamadan önce %60-70'lik bir birleşmeye büyük ölçüd....

Tartışmalar

Tek hücrelerin ve tek çekirdeklerin transkriptomik analizi, karmaşık dokulardaki gen düzenleyici mekanizmaları anlamak için çok önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Her iki yöntem de beyin organoidlerinin transkriptom çalışmalarını mümkün kılar. Genel olarak başarılı bir deney sağlamak için, başlangıç malzemesinin kalitesi yüksek öneme sahiptir. Bu nedenle, nekrotik bir çekirdek oluşumunu önlemek için organoidleri düzenli olarak kesmek gerekir²⁶. Bu sorun.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005