Generación y análisis posterior de transcriptomas de una sola célula y de un solo núcleo en organoides cerebrales

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo integral para la generación y el análisis posterior de organoides cerebrales humanos utilizando la secuenciación de ARN de una sola célula y un solo núcleo.

Resumen

Durante la última década, la transcriptómica de una sola célula ha evolucionado significativamente y se ha convertido en un método de laboratorio estándar para el análisis simultáneo de los perfiles de expresión génica de células individuales, lo que permite la captura de la diversidad celular. Con el fin de superar las limitaciones planteadas por los tipos de células difíciles de aislar, se puede utilizar un enfoque alternativo destinado a recuperar núcleos individuales en lugar de células intactas para la secuenciación, lo que hace que el perfil del transcriptoma de las células individuales sea universalmente aplicable. Estas técnicas se han convertido en una piedra angular en el estudio de los organoides cerebrales, estableciéndolos como modelos del cerebro humano en desarrollo. Aprovechando el potencial de la transcriptómica de una sola célula y de un solo núcleo en la investigación de organoides cerebrales, este protocolo presenta una guía paso a paso que abarca procedimientos clave como la disociación de organoides, el aislamiento de una sola célula o núcleos, la preparación de bibliotecas y la secuenciación. Al implementar estos enfoques alternativos, los investigadores pueden obtener conjuntos de datos de alta calidad, lo que permite la identificación de tipos de células neuronales y no neuronales, perfiles de expresión génica y trayectorias de linaje celular. Esto facilita investigaciones exhaustivas sobre los procesos celulares y los mecanismos moleculares que dan forma al desarrollo del cerebro.

Introducción

En los últimos años, las tecnologías de organoides se han convertido en una herramienta prometedora para el cultivo de tejidos similares a órganos ^1,2,3. Especialmente para los órganos a los que no se puede acceder fácilmente, como el cerebro humano, los organoides ofrecen la oportunidad de obtener información sobre el desarrollo y la manifestación de la enfermedad⁴. Como tal, los organoides cerebrales han sido ampliamente utilizados como modelo experimental para investigar diversos trastornos del cerebro humano, incluidas enfermedades del desarrollo, ....

Protocolo

El protocolo descrito se lleva a cabo en un laboratorio de bioseguridad de nivel 1 del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (número de aprobación: 138/08), de acuerdo con los requisitos y de conformidad con las normas nacionales y de la UE sobre ética en la investigación.

1. Derivación de organoides del prosencéfalo a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

NOTA: Este protocolo se probó para varias líneas diferentes de iPSC cultivadas en una variedad de medios de células madre de diferentes compañías (Tabla 1). La generación de organoides del prosencéfalo depen....

Discusión

El análisis transcriptómico de células individuales y núcleos individuales se ha convertido en una herramienta fundamental para comprender los mecanismos reguladores de genes dentro de tejidos complejos. Ambos métodos permiten el estudio del transcriptoma de los organoides cerebrales. Para garantizar el éxito general del experimento, la calidad del material de partida es de gran relevancia. Por lo tanto, es necesario cortar los organoides con regularidad para evitar la formación de un núcleo necrótico

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005