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脑类器官中单细胞和单核转录组的生成和下游分析
* 这些作者具有相同的贡献
摘要
在这里，我们介绍了一种使用单细胞和单核RNA测序生成和下游分析人脑类器官的综合方案。
摘要
在过去的十年中，单细胞转录组学已经取得了显着发展，并成为同时分析单个细胞基因表达谱的标准实验室方法，从而可以捕获细胞多样性。为了克服难以分离的细胞类型带来的限制，可以使用一种旨在恢复单核而不是完整细胞的替代方法进行测序，使单个细胞的转录组分析普遍适用。这些技术已成为大脑类器官研究的基石，使它们成为发育中的人类大脑的模型。利用单细胞和单核转录组学在脑类器官研究中的潜力，该协议提供了一个分步指南，涵盖了类器官解离、单细胞或细胞核分离、文库制备和测序等关键程序。通过实施这些替代方法，研究人员可以获得高质量的数据集，从而能够识别神经元和非神经元细胞类型、基因表达谱和细胞谱系轨迹。这有助于对塑造大脑发育的细胞过程和分子机制进行全面研究。
引言
在过去的几年中，类器官技术已成为培养器官样组织的一种有前途的工具1,2,3。特别是对于不容易接触到的器官，如人脑，类器官提供了深入了解发育和疾病表现的机会4.因此，大脑类器官已被广泛用作实验模型，用于研究各种人类脑部疾病，包括发育、精神疾病甚至神经退行性疾病 4,5,6。
随着单细胞转录组分析技术的出现，原代人体组织和复杂的体外模型可以以前所未有的粒度水平进行研究，为健康和疾病中细胞亚群水平上的基因表达变化提供机制见解，并为新的假定治疗靶点提供信息7,8,9.通过利用单细胞转录组分析来评估细胞组成、可重复性和大脑类器官技术的保真度，类器官领域取得了进展 10,11,12。
研究方案
所描述的方案在Max Delbrück分子医学中心（批准号：138/08）的生物安全1级实验室中进行，符合要求并符合欧盟和国家的研究伦理规则。
1. 从诱导多能干细胞 （iPSCs） 衍生出前脑类器官
注：该协议已针对在来自不同公司的各种干细胞培养基中培养的几种不同iPSC系进行了测试（表1）。前脑类器官的产生高度依赖于高质量的 iPSC 和 60%-70% 的汇合度，然后才能开始实验方案。在这里，我们使用了市售的细胞系（参见 材料表）。
- 第 0 天：胚状体形成
- 对于用 pluronic 溶液处理 96 孔板，在 96 孔 U 底板的每孔中加入 80 μL 无菌过滤的 2% pluronic 溶液。在室温 （RT） 或 37 °C 下孵育至少 15 分钟。
注意：Pluronic 处理板可在 4 °C 下储存长达 2 周，并且可以直接使用，无需任何洗涤步骤即可形成胚状体。 - 在接种细胞之前，使用抽吸器或多通道移液器从每个孔中取出 pluronic 溶液。
- 在开始之前，为一个 96 孔板准备以下试剂：15 mL 离心管和 5 mL 预热的 DMEM：F12 培养基;11 mL 补充有 50 μM Y-27632 的干细胞培养基，经多糖醛处理的....
- 对于用 pluronic 溶液处理 96 孔板，在 96 孔 U 底板的每孔中加入 80 μL 无菌过滤的 2% pluronic 溶液。在室温 （RT） 或 37 °C 下孵育至少 15 分钟。
代表性结果
为了使用 scRNA-seq 和 snRNA-seq 研究脑类器官的细胞类型组成，在培养 30 天后收获脑类器官，因为该阶段的类器官已经表现出由中间祖细胞包围的祖细胞和早期神经元组成的神经上皮环 4,18。在整个生长和培养过程中监测类器官的质量对于获得可靠的单细胞和单核数据至关重要。
类器官是通过将iPSC聚集到胚状体中而形成的（
讨论
单细胞和单细胞核的转录组学分析已成为理解复杂组织内基因调控机制的关键工具。这两种方法都可以对大脑类器官进行转录组研究。为了确保实验的整体成功，起始材料的质量具有高度相关性。因此，有必要定期切割类器官以防止形成坏死核心26。也可以通过气液界面培养物来消除这个问题27.为了减少由于类器官异质性导致的批量效应，我们建议每次提取至?.......
披露声明
作者声明没有相互竞争的经济利益。
致谢
我们感谢 Valeria Fernandez-Vallone 提供 Miltenyi 神经解离套件的原始说明。我们还要感谢 Max Delbrueck Centrum 的基因组学技术平台提供 NP40 裂解缓冲液的配方和建立此方案的宝贵建议。我们还要感谢玛格丽塔·赫尔佐格（Margareta Herzog）和亚历山德拉·切尔尼切夫（Alexandra Tschernycheff）对实验室组织的支持。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin - Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
参考文献
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al.
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