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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, introduciamo un protocollo completo per la generazione e l'analisi a valle di organoidi cerebrali umani utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo.

Abstract

Nell'ultimo decennio, la trascrittomica a singola cellula si è evoluta in modo significativo ed è diventata un metodo di laboratorio standard per l'analisi simultanea dei profili di espressione genica delle singole cellule, consentendo la cattura della diversità cellulare. Al fine di superare i limiti posti dai tipi di cellule difficili da isolare, è possibile utilizzare un approccio alternativo che mira a recuperare singoli nuclei anziché cellule intatte, rendendo la profilazione del trascrittoma delle singole cellule universalmente applicabile. Queste tecniche sono diventate una pietra miliare nello studio degli organoidi cerebrali, affermandoli come modelli del cervello umano in via di sviluppo. Sfruttando il potenziale della trascrittomica a singola cellula e a singolo nucleo nella ricerca sugli organoidi cerebrali, questo protocollo presenta una guida passo-passo che comprende procedure chiave come la dissociazione degli organoidi, l'isolamento di singole cellule o nuclei, la preparazione e il sequenziamento delle librerie. Implementando questi approcci alternativi, i ricercatori possono ottenere set di dati di alta qualità, consentendo l'identificazione di tipi di cellule neuronali e non neuronali, profili di espressione genica e traiettorie di linea cellulare. Ciò facilita indagini complete sui processi cellulari e sui meccanismi molecolari che modellano lo sviluppo del cervello.

Introduzione

Negli ultimi anni, le tecnologie degli organoidi sono emerse come uno strumento promettente per la coltura di tessuti simili a organi 1,2,3. Soprattutto per gli organi che non sono facilmente accessibili, come il cervello umano, gli organoidi offrono l'opportunità di ottenere informazioni sullo sviluppo e sulla manifestazione della malattia4. In quanto tali, gli organoidi cerebrali sono stati ampiamente utilizzati come modello sperimentale per studiare vari disturbi del cervello umano, tra cui malattie dello sviluppo, psichiatriche o persino neurodegenerative 4,5,6.

Con l'avvento delle tecnologie di profilazione del trascrittoma a singola cellula, i tessuti umani primari e i modelli complessi in vitro potrebbero essere studiati con un livello di granularità senza precedenti, fornendo informazioni meccanicistiche sui cambiamenti dell'espressione genica a livello di sottopopolazioni cellulari in salute e malattia e fornendo informazioni su nuovi bersagli terapeutici putativi 7,8,9. Il campo degli organoidi è progredito utilizzando il profilo del trascrittoma a singola cellula per valutare la composizione cellulare, la riproducibilità e la fedeltà delle tecnologie degli organoidi cerebrali 10,11,12. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha permesso la classificazione cellulare e l'identificazione della disregolazione genetica negli organoidi malati13,14. È importante sottolineare che è la complessità dei tessuti organoidi che richiede l'implementazione di tecniche che consentano la profilazione delle singole cellule. La caratterizzazione degli organoidi utilizzando metodi come la profilazione del trascrittoma di massa (sequenziamento dell'RNA di massa) porta all'eterogeneità cellulare mascherata e ai profili di espressione genica che sono mediati in tutti i tipi di cellule all'interno del tessuto complesso, limitando in ultima analisi la nostra comprensione dei processi in corso durante lo sviluppo degli organoidi in salute e malattia 15,16,17. Man mano che i metodi scRNA-seq continuano ad avanzare, viene creato un numero crescente di atlanti, esemplificato da risorse come l'Allen Brain Atlas o l'atlante a cellula singola di organoidi cerebrali umani di Uzquiano et al.18.

Il successo dello scRNA-seq da organoidi cerebrali si basa su un efficace isolamento e cattura di cellule intatte. Poiché la dissociazione degli organoidi cerebrali per ottenere singole cellule si basa sulla digestione enzimatica, può influenzare i modelli di espressione genica inducendo stress e danno cellulare19,20. Quindi, la dissociazione del tessuto in singole cellule è il passaggio più cruciale. Un approccio alternativo è il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo (snRNA-seq), che facilita l'estrazione senza enzimi di nuclei da tessuti freschi e congelati21,22. Tuttavia, l'isolamento dei nuclei da un tessuto pone altre sfide come l'arricchimento dei tipi di cellule di interesse e il basso contenuto di RNA dei nuclei rispetto alle cellule.

Gli studi con trascrittoma degli organoidi cerebrali sono comunemente condotti utilizzando scRNA-seq 10,18,23. Tuttavia, l'isolamento di singoli nuclei potrebbe fornire un metodo ortogonale e supplementare per studiare il profilo trascrittomico degli organoidi. Qui, introduciamo una cassetta degli attrezzi per scRNA- e snRNA-seq per organoidi cerebrali e discutiamo i punti critici per ottenere dati di sequenziamento della migliore qualità.

Protocollo

Il protocollo descritto viene eseguito in un laboratorio di biosicurezza di livello 1 del Max Delbrück Center for Molecular Medicine (numero di approvazione: 138/08), in conformità con i requisiti e in conformità con le norme dell'UE e nazionali sull'etica nella ricerca.

1. Derivazione di organoidi del prosencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

NOTA: Questo protocollo è stato testato per diverse linee di iPSC coltivate in una varietà di terreni di cellule staminali di diverse aziende (Tabella 1). La generazione di organoidi del proencefalo dipende fortemente da iPSC di alta qualità e da una confluenza del 60%-70% prima dell'inizio del protocollo. Qui abbiamo utilizzato una linea cellulare disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).

  1. Giorno 0: Formazione del corpo embrioide
    1. Per il trattamento di una piastra a 96 pozzetti con soluzione pluronica, aggiungere 80 μl di soluzione pluronica sterile filtrata al 2% per pozzetto di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Incubare per almeno 15 minuti a temperatura ambiente (RT) o 37 °C.
      NOTA: Le piastre trattate con pluronic possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane e possono essere utilizzate direttamente senza alcuna fase di lavaggio per la formazione del corpo embrioide.
    2. Rimuovere la soluzione pluronica da ciascun pozzetto utilizzando un aspiratore o una pipetta multicanale prima di seminare le cellule.
    3. Prima di iniziare, preparare i seguenti reagenti per una piastra a 96 pozzetti: provetta da centrifuga da 15 mL con 5 mL di terreno preriscaldato DMEM: F12; 11 mL di terreno di coltura di cellule staminali integrato con 50 μM di Y-27632, piastra trattata con pluronico (come descritto sopra).
    4. Aspirare il terreno da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con iPSC confluenti al 60-70%. Lavare le celle una volta con PBS. Aggiungere 500 μl di reagente a base di tripsina e incubare per 2-6 minuti a 37 °C.
      NOTA: Il tempo di incubazione per il corretto distacco delle cellule con il reagente a base di tripsina dipende dalla densità cellulare e dalle proprietà di adesione della matrice cellulare di ciascuna linea iPSC. Per evitare una digestione eccessiva, si consiglia di esaminare la morfologia cellulare dopo 2 minuti di incubazione con un reagente a base di tripsina utilizzando un microscopio a campo chiaro.
    5. Staccare le cellule con una pipetta da 1000 μL e trasferirle nella provetta da centrifuga da 15 mL precedentemente preparata con terreno DMEM:F12 per arrestare la dissociazione.
    6. Sospensione in cella di centrifugazione per 3 minuti a 300 x g. Aspirare il surnatante e conservare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di cellule staminali integrato con 50 μM di Y-27632.
    7. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule e aggiungere il numero desiderato di cellule al terreno di coltura delle cellule staminali integrato con 50 μM di Y-27632. La generazione di un singolo corpo embrioide richiede 3.000-12.000 cellule a seconda della linea cellulare.
    8. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di reagenti multicanale utilizzando una pipetta da 10 mL. Utilizzando una pipetta multicanale, posizionare 100 μL/pozzetto della sospensione cellulare nella piastra a 96 pozzetti precedentemente trattata con pluronico.
    9. Porre la piastra a 96 pozzetti in un incubatore a 37 °C, 5% O2 e 5% CO2. Per evitare qualsiasi disturbo durante la formazione del corpo embrioide, astenersi dal muovere la piastra.
  2. Giorno 2: Esame di formazione del corpo embrioide
    1. Esamina la formazione del corpo embrioide utilizzando un obiettivo 10x di un microscopio a campo chiaro. I corpi embrioidi dovrebbero mostrare bordi chiari e una morte cellulare minima.
    2. Aspirare quanto più terreno possibile e sostituirlo con 100 μL/pozzetto di terreno di cellule staminali. (Critico) I corpi embrioidi vengono facilmente rimossi dal pozzetto durante lo scambio del mezzo. Prestare attenzione a non rimuoverli, quindi monitorare il terreno dopo l'aspirazione.
  3. Giorno 3: Induzione del neuroectoderma
    1. Aspirare quanto più terreno possibile e sostituirlo con 120 μL/pozzetto di terreno di induzione e posizionare la piastra a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2.
  4. Giorno 6: Incorporamento
    1. A seconda della linea iPSC, sono necessari 3 o 4 giorni per indurre l'emergenza del neuroectoderma. Monitorare regolarmente i corpi embrioidi. Una volta che i bordi diventano luminosi, i corpi embrioidi sono pronti per l'inclusione. Utilizzare uno dei due diversi metodi che possono essere utilizzati per l'inclusione di corpi embrioidi come descritto di seguito24.
    2. Metodo di incorporamento 1: Incorporamento di cookie
      1. Scongelare un'aliquota di gel per matrice extracellulare non diluito su ghiaccio per 1-2 ore. (Critico) Tenere sempre il gel per matrice extracellulare su ghiaccio per evitare che si solidifichi. Preparare le aliquote in anticipo per ridurre al minimo il tempo di scongelamento e i cicli di scongelamento ripetuti.
      2. Tagliare la punta di una pipetta da 200 μl utilizzando una tronchesina ad artiglio e raccogliere 16-32 corpi embrioidi in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
      3. Trasferire i corpi embrioidi in 67 μL di terreno in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 100 μl di gel per matrice extracellulare utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl tagliato e mescolare delicatamente.
      4. Distribuire uniformemente i corpi embrioidi in un piatto di 6 cm e posizionare la piastra per 5-10 minuti per consentire al gel della matrice extracellulare di solidificarsi.
      5. Aggiungere circa 4 mL di terreno di differenziazione e incubare a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2. Il giorno successivo, posizionare la capsula su uno shaker orbitale (84 giri/min). Assicurati che tutti i corpi embrioidi si stacchino dal fondo. In caso contrario, utilizzare un puntale della pipetta tagliato e un terreno per staccarli delicatamente.
    3. Metodo di inclusione 2: Inclusione liquida
      1. Scongelare un'aliquota di gel di matrice extracellulare non diluito su ghiaccio per 1-2 ore e posizionare i mezzi di differenziazione su ghiaccio. (Critico) I terreni devono essere ghiacciati quando si aggiunge il gel per matrici extracellulari.
      2. Una volta che il terreno è freddo, aggiungere il gel della matrice extracellulare alla concentrazione finale del 2%. Tagliare la punta di una pipetta da 200 μl utilizzando una tronchesa ad artiglio e trasferire fino a 24 corpi embrioidi in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
      3. Rimuovere tutti i terreni in eccesso e aggiungere circa 4 mL di gel/terreno di differenziazione della matrice extracellulare al 2% in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Posizionare immediatamente la piastra sull'agitatore orbitale (84 giri/min).
  5. Giorno 9-20: Eseguire uno scambio completo di supporti utilizzando i mezzi di differenziazione ogni 3-4 giorni.
  6. Giorno 21-30: Trasferire gli organoidi nei terreni di maturazione ed eseguire scambi completi dei terreni ogni 3-4 giorni.
  7. Dissociazione di organoidi: per la dissociazione di singoli nuclei e cellule, utilizzare organoidi di alta qualità. Per evitare quantità eccessive di morte cellulare, tagliare regolarmente gli organoidi per prevenire l'accumulo di un nucleo necrotico e lasciarli recuperare per 2 settimane prima di dissociarli per ulteriori analisi.

2. Derivazione di singole cellule da organoidi

NOTA: La dissociazione di singole cellule viene eseguita utilizzando il kit di dissociazione del tessuto neurale (Tabella 2), che utilizza la dissociazione meccanica ed enzimatica. Qui descriviamo una dissociazione meccanica manuale. In alternativa, è possibile utilizzare una macchina di dissociazione.

  1. Preparare la soluzione STOP e lo 0,04% di BSA con ghiaccio. Preparare la miscela enzimatica 1 e 2 e lo 0,04% di BSA in PBS e porre sul ghiaccio.
  2. Raccogliere fino a 5 organoidi in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e aspirare il terreno in eccesso e lavare una volta con PBS per rimuovere il terreno di coltura. Posizionare gli organoidi al centro del pozzetto e, utilizzando un bisturi, tritare accuratamente gli organoidi.
  3. Aggiungere la miscela enzimatica 1 e porre a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2, agitando a 90 giri/min per 10-15 min.
  4. Utilizzando un puntale per pipetta da 1000 μl, risospendere gli organoidi pipettandoli fino a 10x. Aggiungere la miscela enzimatica 2 e miscelarla bene pipettandola con un puntale per pipetta da 1000 μl. Porre a 37 °C, 20% O2 e 5% CO2, agitando a 90 giri/min per 10-15 min.
  5. Arrestare il processo di dissociazione risospendendo la soluzione cellulare in 10 mL di soluzione fredda STOP. Soluzione di cella filtrante utilizzando un filtro cellulare da 70 μM. Centrifugare la soluzione di cella filtrata per 10 minuti a 300 x g a 4 °C per formare un pellet.
  6. Aspirare il terreno, lasciando un pellet di cellule e risospendere le cellule in 4 mL di BSA freddo allo 0,04%. Filtrare la soluzione della cella utilizzando un filtro cellulare da 40 μM e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule.
  7. Centrifugare la soluzione cellulare per 10 minuti a 300 x g a 4 °C. Aspirare la soluzione BSA, lasciando un pellet cellulare. Risospendere le cellule secondo un manuale del kit snRNA-seq basato sulla microfluidica in terreno NSB+.

3. Isolamento di singoli nuclei da organoidi

  1. Trasferire gli organoidi in PBS refrigerato e tagliare ogni organoide in 4 pezzi. Lavare gli organoidi 2 volte con PBS refrigerato.
  2. Tagliare con le forbici il puntale di una pipetta da 1000 μL e trasferire i pezzi di organoide in un dosatore da 2 mL. Aspirare completamente il PBS e aggiungere 1 mL di tampone di lisi NP40.
  3. Dounce 3 volte con il pestello a lancia A e 3 volte con il pestello a lancia B. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 mL. Lavare il douncer con un ulteriore 1 mL di tampone di lisi NP40 e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 mL. Incubare per 5 minuti a RT e successivamente centrifugare la sospensione per 5 minuti a 500 x g.
  4. Aspirare il surnatante lasciando dietro di sé 50 μL di surnatante. Aggiungere 1 mL di NSB+ senza disturbare il pellet. Risospendere dopo 5 minuti di incubazione.
  5. Sospensione a strati su un gradiente di Percoll (strato inferiore: 1 mL di NSB+ e 250 μL di Percoll, strato intermedio: 1 mL di NSB+ e 188 μL di Percoll, strato superiore: 1 mL di NSB+ e 125 μL di Percoll). (Critico) Eseguire la stratificazione con molta attenzione per evitare la miscelazione degli strati.
  6. Centrifugare per 5 minuti a 500 x g a 4 °C, aspirare il surnatante e risospendere in NSB+. Filtrare la soluzione dei nuclei utilizzando un filtro cellulare da 40 μM.
  7. Colorare e contare i nuclei utilizzando DAPI e una camera di Neubauer. Risospendere i nuclei secondo un manuale del kit scRNA-seq basato sulla microfluidica.

4. Preparazione e sequenziamento della libreria

  1. Caricare 10.000 cellule e nuclei in un sistema microfluidico e generare la libreria secondo il manuale del kit scRNA-seq basato sulla microfluidica (Tabella dei materiali).
  2. Sequenziare le librerie con una stima di 6 x 108 letture per libreria snRNA-seq e 1,6 x 108 letture per libreria scRNA-seq, con una saturazione del sequenziamento dell'87% per il set di dati snRNA-seq e del 36% per il set di dati scRNA-seq.

5. Analisi

  1. Eseguire l'analisi del sequenziamento utilizzando una pipeline di analisi dei dati per scRNA-seq e snRNA-seq e allinearsi con il genoma umano GRCh38. Sottoporre la matrice di conteggio generata da questa pipeline a un'ulteriore analisi utilizzando il pacchetto R Seurat (versione 4.1.1)25.
  2. Crea l'oggetto Seurat considerando i geni che sono stati rappresentati in almeno 5 cellule e incorporando cellule che contenevano almeno 300 geni. Eseguire un ulteriore filtraggio del controllo di qualità conservando le cellule che contenevano più di 1000 geni ma meno di 4000 geni per il set di dati scRNA-seq e più di 800, ma meno di 4000 geni per nuclei per il set di dati snRNA-seq. Escludere set di dati, cellule e nuclei che superano il 5% di letture mitocondriali.
  3. Per mitigare gli effetti batch tra i due metodi, integrare entrambi i set di dati filtrati, normalizzare e visualizzare tramite UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection). Omettere il cluster 1 che visualizza un basso numero di identificatori molecolari univoci (UMI) e geni. Successivamente, per i cluster, assegna le identità cellulari in base ai geni marcatori noti e al set di dati di organoidi di 30 giorni di Ana Uzquiano et. al. (File di codifica supplementare 1)18.

Risultati

Per studiare la composizione del tipo di cellula degli organoidi cerebrali utilizzando scRNA-seq e snRNA-seq, gli organoidi cerebrali sono stati raccolti dopo 30 giorni di coltura poiché gli organoidi in questa fase mostrano già loop neuroepiteliali costituiti da progenitori circondati da progenitori intermedi e neuroni allo stadio iniziale 4,18. Il monitoraggio della qualità degli organoidi durante la crescita e la coltura è essenziale per ottenere dati affi...

Discussione

L'analisi trascrittomica di singole cellule e singoli nuclei è emersa come uno strumento fondamentale per comprendere i meccanismi di regolazione genica all'interno di tessuti complessi. Entrambi i metodi consentono studi sul trascrittoma di organoidi cerebrali. Per garantire un esperimento complessivamente riuscito, la qualità del materiale di partenza è di grande importanza. Pertanto, è necessario tagliare regolarmente gli organoidi per evitare la formazione di un nucleo necrotico26. È anch...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Ringraziamo Valeria Fernandez-Vallone per le istruzioni originali per il kit di dissociazione neurale Miltenyi. Ringraziamo anche la Genomics Technology Platform del Max Delbrueck Centrum per aver fornito la ricetta del tampone di lisi NP40 e i preziosi consigli per la messa a punto di questo protocollo. Ringraziamo anche Margareta Herzog e Alexandra Tschernycheff per il supporto organizzativo del laboratorio.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

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