Génération et analyse en aval de transcriptomes unicellulaires et mononucléiaux dans des organoïdes cérébraux

Résumé

Ici, nous présentons un protocole complet pour la génération et l’analyse en aval d’organoïdes cérébraux humains à l’aide du séquençage de l’ARN unicellulaire et mononucléique.

Résumé

Au cours de la dernière décennie, la transcriptomique unicellulaire a considérablement évolué et est devenue une méthode de laboratoire standard pour l’analyse simultanée des profils d’expression génique de cellules individuelles, permettant de capturer la diversité cellulaire. Afin de surmonter les limites posées par les types de cellules difficiles à isoler, une approche alternative visant à récupérer des noyaux uniques au lieu de cellules intactes peut être utilisée pour le séquençage, ce qui rend le profilage du transcriptome des cellules individuelles universellement applicable. Ces techniques sont devenues une pierre angulaire dans l’étude des organoïdes cérébraux, les établissant comme des modèles du cerveau humain en développement. Exploitant le potentiel de la transcriptomique unicellulaire et mononucléus dans la recherche sur les organoïdes cérébraux, ce protocole présente un guide étape par étape englobant des procédures clés telles que la dissociation des organoïdes, l’isolement d’une cellule unique ou de noyaux, la préparation de banques et le séquençage. En mettant en œuvre ces approches alternatives, les chercheurs peuvent obtenir des ensembles de données de haute qualité, permettant l’identification de types de cellules neuronales et non neuronales, de profils d’expression génique et de trajectoires de lignées cellulaires. Cela facilite l’étude approfondie des processus cellulaires et des mécanismes moléculaires qui façonnent le développement du cerveau.

Introduction

Au cours des dernières années, les technologies des organoïdes sont apparues comme un outil prometteur pour la culture de tissus semblables à des organes ^1,2,3. En particulier pour les organes qui ne sont pas facilement accessibles, comme le cerveau humain, les organoïdes offrent la possibilité d’obtenir des informations sur le développement et la manifestation de la maladie⁴. En tant que tels, les organoïdes cérébraux ont été largement utilisés comme modèle expérimental pour étudier divers troubles du cerveau humain, y compris les maladies développementales, psychiatriques ou même neurodégénératives ^4,5,6.

Avec l’avènement des technologies de profilage du transcriptome unicellulaire, les tissus humains primaires et les modèles in vitro complexes ont pu être étudiés avec un niveau de granularité sans précédent, fournissant des informations mécanistes sur les changements d’expression génique au niveau des sous-populations cellulaires en santé et en maladie et informant sur de nouvelles cibles thérapeutiques présumées ^7,8,9. Le domaine des organoïdes a progressé en utilisant le profilage du transcriptome unicellulaire pour évaluer la composition cellulaire, la reproductibilité et la fidélité des technologies organoïdes cérébraux 10,11,12. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a permis la classification cellulaire et l’identification de la dysrégulation génétique chez les organoïdes malades^13,14. Il est important de noter que c’est la complexité des tissus organoïdes qui nécessite la mise en œuvre de techniques permettant le profilage de cellules individuelles. La caractérisation des organoïdes à l’aide de méthodes telles que le profilage du transcriptome en vrac (séquençage de l’ARN en vrac) conduit à une hétérogénéité cellulaire masquée et à des profils d’expression génique qui sont moyennés sur tous les types de cellules du tissu complexe, limitant finalement notre compréhension des processus en cours au cours du développement des organoïdes dans la santé et la maladie 15,16,17. Au fur et à mesure que les méthodes de séquençage de l’ARNsc continuent de progresser, un nombre croissant d’atlas sont créés, comme en témoignent des ressources telles que l’Allen Brain Atlas ou l’Atlas unicellulaire des organoïdes du cerveau humain d’Uzquiano et ^al.18.

La réussite du séquençage de l’ARNsc à partir d’organoïdes cérébraux repose sur l’isolement et la capture efficaces de cellules intactes. Comme la dissociation des organoïdes cérébraux pour obtenir des cellules individuelles est basée sur la digestion enzymatique, elle peut influencer les modèles d’expression génique en induisant le stress et les dommages cellulaires^19,20. Par conséquent, la dissociation du tissu en cellules individuelles est l’étape la plus cruciale. Une autre approche est le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq), qui facilite l’extraction sans enzyme des noyaux à partir de tissus, frais et congelés^21,22. Cependant, l’isolement des noyaux d’un tissu pose d’autres défis tels que l’enrichissement des types cellulaires d’intérêt et la faible teneur en ARN des noyaux par rapport aux cellules.

Les études du transcriptome des organoïdes cérébraux sont couramment menées à l’aide du scRNA-seq 10,18,23. Cependant, l’isolement de noyaux uniques pourrait fournir une méthode orthogonale et supplémentaire pour étudier le profil transcriptomique des organoïdes. Ici, nous présentons une boîte à outils pour le séquençage de l’ARNsc et de l’ARNns pour les organoïdes cérébraux et discutons des points critiques pour obtenir des données de séquençage de la meilleure qualité.

Protocole

Le protocole décrit est réalisé dans un laboratoire de biosécurité de niveau 1 du Centre Max Delbrück de médecine moléculaire (numéro d’approbation : 138/08), conformément aux exigences et aux règles européennes et nationales en matière d’éthique de la recherche.

1. Dérivation d’organoïdes du cerveau antérieur à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC)

REMARQUE : Ce protocole a été testé pour plusieurs lignées iPSC différentes cultivées dans une variété de milieux de cellules souches de différentes sociétés (tableau 1). La génération d’organoïdes du cerveau antérieur dépend fortement des iPSC de haute qualité et d’une confluence de 60 % à 70 % avant le début du protocole. Ici, nous avons utilisé une lignée cellulaire disponible dans le commerce (voir la table des matériaux).

1. Jour 0 : Formation du corps embryoïde
   1. Pour le traitement d’une plaque à 96 puits avec une solution pluronique, ajouter 80 μL de solution puronique stérile filtrée à 2 % par puits d’une plaque à fond en U à 96 puits. Incuber pendant au moins 15 min à température ambiante (RT) ou 37 °C.
      REMARQUE : Les plaques traitées par Pluronic peuvent être stockées à 4 °C jusqu’à 2 semaines et peuvent être utilisées directement sans aucune étape de lavage pour la formation de corps embryoïdes.
   2. Retirer la solution pluronique de chaque puits à l’aide d’un aspirateur ou d’une pipette multicanaux avant d’ensemencer les cellules.
   3. Avant de commencer, préparez les réactifs suivants pour une plaque à 96 puits : tube à centrifuger de 15 mL avec 5 mL de DMEM préchauffé : milieu F12 ; 11 mL de milieu de cellules souches complété par 50 μM de Y-27632, plaque traitée au pluronique (comme décrit ci-dessus).
   4. Aspirer le milieu d’un puits d’une plaque de 6 puits de 60 à 70 % d’iPSC confluents. Lavez les cellules une fois avec du PBS. Ajouter 500 μL de réactif à base de trypsine et incuber pendant 2 à 6 minutes à 37 °C.
      REMARQUE : Le temps d’incubation pour un bon détachement des cellules avec un réactif à base de trypsine dépend de la densité cellulaire et des propriétés adhésives de la matrice cellulaire de chaque lignée iPSC. Pour éviter une surdigestion, il est conseillé d’examiner la morphologie cellulaire après 2 min d’incubation avec un réactif à base de trypsine à l’aide d’un microscope à champ clair.
   5. Détachez les cellules à l’aide d’une pipette de 1000 μL et transférez-les dans le tube à centrifuger de 15 mL préalablement préparé avec un milieu DMEM :F12 pour arrêter la dissociation.
   6. Suspension de la cellule de centrifugation pendant 3 min à 300 x g. Aspirer le surnageant et conserver la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de cellules souches complété par 50 μM d’Y-27632.
   7. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ajoutez le nombre souhaité de cellules au milieu de cellules souches complété par 50 μM Y-27632. La génération d’un seul corps embryoïde nécessite 3 000 à 12 000 cellules selon la lignée cellulaire.
   8. Transférez la suspension cellulaire dans un réservoir de réactif multicanaux à l’aide d’une pipette de 10 ml. À l’aide d’une pipette multicanaux, déposer 100 μL/puits de suspension cellulaire dans la plaque à 96 puits préalablement traitée par pluronic.
   9. Placer la plaque à 96 puits dans un incubateur à 37 °C, 5 % d’O₂ et 5 % de CO₂. Pour éviter toute perturbation lors de la formation du corps embryoïde, évitez de déplacer la plaque.
2. Jour 2 : Examen de la formation du corps embryoïde
   1. Examinez la formation du corps embryoïde à l’aide d’un objectif 10x d’un microscope à champ clair. Les corps embryoïdes doivent présenter des bords clairs et une mort cellulaire minimale.
   2. Aspirez autant de milieu que possible et remplacez-le par 100 μL/puits de milieu de cellules souches. (Critique) Les corps embryoïdes sont facilement retirés du puits lors de l’échange de fluides. Faites attention à ne pas les enlever, alors surveillez le milieu après l’aspiration.
3. Jour 3 : Induction du neuroectoderme
   1. Aspirer autant de fluide que possible et le remplacer par 120 μL/puits de fluide à induction et placer la plaque à 37 °C, 20 % O₂ et 5 % CO₂.
4. Jour 6 : Encastrement
   1. Selon la lignée iPSC, 3 ou 4 jours sont nécessaires pour induire l’émergence du neuroectoderme. Surveillez régulièrement les corps embryoïdes. Une fois que les bords deviennent brillants, les corps embryoïdes sont prêts à s’encastrer. Utilisez l’une des deux méthodes différentes qui peuvent être utilisées pour l’intégration du corps embryoïde, comme décrit ci-dessous²⁴.
   2. Méthode d’intégration 1 : Intégration des cookies
      1. Décongelez une aliquote de gel de matrice extracellulaire non diluée sur de la glace pendant 1 à 2 h. (Critique) Conservez toujours le gel de matrice extracellulaire sur de la glace pour éviter qu’il ne se solidifie. Préparez les aliquotes à l’avance pour minimiser le temps de décongélation et les cycles de décongélation répétés.
      2. Coupez l’extrémité d’une pipette de 200 μL à l’aide d’une pince à griffes et prélevez 16 à 32 corps embryoïdes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
      3. Transférez les corps embryoïdes dans 67 μL du milieu dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Ajouter 100 μL de gel de matrice extracellulaire à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 200 μL et mélanger délicatement.
      4. Répartissez uniformément les corps embryoïdes dans une boîte de 6 cm et placez la plaque pendant 5 à 10 minutes pour permettre au gel de matrice extracellulaire de se solidifier.
      5. Ajouter environ 4 mL de milieu de différenciation et incuber à 37 °C, 20 % d’O2 et 5 % de CO₂. Le lendemain, placez le plat sur un agitateur orbital (84 tr/min). Assurez-vous que tous les corps embryoïdes se détachent du bas. Si ce n’est pas le cas, utilisez une pointe de pipette coupée et un support pour les détacher délicatement.
   3. Méthode d’enrobage 2 : Enrobage liquide
      1. Décongeler une aliquote de gel de matrice extracellulaire non dilué sur de la glace pendant 1 à 2 h et placer le milieu de différenciation sur la glace. (Critique) Le support doit être glacé lors de l’ajout de gel de matrice extracellulaire.
      2. Une fois que le milieu est froid, ajoutez du gel de matrice extracellulaire à la concentration finale de 2%. Coupez l’extrémité d’une pipette de 200 μL à l’aide d’une pince à griffes et transférez jusqu’à 24 corps embryoïdes dans un puits d’une plaque à 6 puits.
      3. Retirer tout l’excédent de milieu et ajouter environ 4 ml de gel de matrice extracellulaire à 2 % ou de milieu de différenciation dans un puits d’une plaque à 6 puits. Placez immédiatement la plaque sur l’agitateur orbital (84 tr/min).
5. Jour 9-20 : Effectuez un échange complet de milieux à l’aide de milieux de différenciation tous les 3-4 jours.
6. Jour 21-30 : Transférer les organoïdes dans les milieux de maturation et effectuer des échanges complets de milieux tous les 3-4 jours.
7. Dissociation des organoïdes : Pour les noyaux uniques et la dissociation cellulaire, utilisez des organoïdes de haute qualité. Pour éviter des quantités excessives de mort cellulaire, coupez régulièrement les organoïdes pour éviter l’accumulation d’un noyau nécrotique et laissez-les récupérer pendant 2 semaines avant de les dissocier pour une analyse plus approfondie.

2. Dérivation d’une cellule unique à partir d’organoïdes

REMARQUE : La dissociation d’une seule cellule est réalisée à l’aide du kit de dissociation du tissu neural (tableau 2), qui utilise la dissociation mécanique et enzymatique. Nous décrivons ici une dissociation mécanique manuelle. Comme alternative, une machine de dissociation peut être utilisée.

1. Préparez la solution STOP et l’BSA à 0,04 % sur de la glace. Préparez le mélange d’enzymes 1 et 2 et 0,04 % de BSA dans du PBS et placez-le sur de la glace.
2. Recueillir jusqu’à 5 organoïdes dans un puits d’une plaque à 6 puits et aspirer l’excédent de milieu et laver une fois avec du PBS pour éliminer le milieu de culture. Placez les organoïdes au milieu du puits et, à l’aide d’un scalpel, émincez soigneusement les organoïdes.
3. Ajouter le mélange d’enzymes 1 et placer à 37 °C, 20 % d’O₂ et 5 % de CO₂, en agitant à 90 tr/min pendant 10-15 min.
4. À l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL, remettez les organoïdes en suspension en pipetant jusqu’à 10x. Ajoutez le mélange d’enzymes 2 et mélangez-le bien en le pipetant à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL. Placer à 37 °C, 20% O₂ et 5% CO₂, en agitant à 90 tr/min pendant 10-15 min.
5. Arrêtez le processus de dissociation en remettant en suspension la solution cellulaire dans 10 mL de solution froide STOP. Filtrer la solution de la cellule à l’aide d’une crépine de 70 μM. Centrifuger la solution de cellule filtrée pendant 10 min à 300 x g à 4 °C pour former une pastille.
6. Aspirer le milieu en laissant une pastille cellulaire et remettre les cellules en suspension dans 4 mL de BSA froid à 0,04 %. Filtrez la solution cellulaire à l’aide d’une crépine de 40 μM et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
7. Centrifuger la solution cellulaire pendant 10 min à 300 x g à 4 °C. Aspirer la solution de BSA, en laissant une pastille de cellule. Remettez les cellules en suspension selon le manuel du kit de séquençage de l’ARNns basé sur la microfluidique dans un milieu NSB+.

3. Isolement de noyaux uniques à partir d’organoïdes

1. Transférez les organoïdes dans du PBS réfrigéré et coupez chaque organoïde en 4 morceaux. Laver les organoïdes 2 fois avec du PBS réfrigéré.
2. Coupez avec des ciseaux la pointe d’une pipette de 1000 μL et transférez les morceaux d’organoïde dans un bec de 2 mL. Aspirez complètement le PBS et ajoutez 1 mL de tampon de lyse NP40.
3. Déposer 3 fois avec le pilon A et 3 fois avec le pilon B. Transférer la suspension dans un tube à centrifuger de 15 ml. Lavez le dénonceur avec 1 ml supplémentaire de tampon de lyse NP40 et transférez-le dans un tube à centrifuger de 15 ml. Incuber pendant 5 min à RT, puis centrifuger la suspension pendant 5 min à 500 x g.
4. Aspirer le surnageant en laissant 50 μL de surnageant. Ajouter 1 mL de NSB+ sans déranger la pastille. Remettre en suspension après 5 min d’incubation.
5. Suspension de couche sur un dégradé de Percoll (couche inférieure : 1 mL de NSB+ et 250 μL de Percoll, couche intermédiaire : 1 mL de NSB+ et 188 μL de Percoll, couche supérieure : 1 mL de NSB+ et 125 μL de Percoll). (Critique) Effectuez la superposition très soigneusement pour éviter le mélange des couches.
6. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans NSB+. Filtrer la solution des noyaux à l’aide d’une crépine à cellules de 40 μM.
7. Colorez et comptez les noyaux à l’aide de DAPI et d’une chambre de Neubauer. Remettre les noyaux en suspension selon le manuel du kit scRNA-seq basé sur la microfluidique.

4. Préparation et séquençage de la bibliothèque

1. Chargez 10 000 cellules et noyaux dans un système microfluidique et générez la bibliothèque selon le manuel du kit scRNA-seq (Table of Materials) basé sur la microfluidique.
2. Séquencez les banques avec une estimation de 6 x 10⁸ lectures par bibliothèque snRNA-seq et de 1,6 x 10⁸ lectures par bibliothèque scRNA-seq, ce qui donne une saturation de séquençage de 87 % pour l’ensemble de données snRNA-seq et de 36 % pour l’ensemble de données scRNA-seq.

5. Analyse

1. Effectuez l’analyse du séquençage à l’aide d’un pipeline d’analyse de données pour le scRNA-seq et le snRNA-seq et alignez-vous sur le génome humain GRCh38. Soumettre la matrice de comptage générée par ce pipeline à une analyse plus approfondie à l’aide du R-package Seurat (Version 4.1.1)²⁵.
2. Créez l’objet Seurat en considérant les gènes représentés dans au moins 5 cellules et en incorporant des cellules contenant au moins 300 gènes. Effectuez un filtrage de contrôle qualité supplémentaire en conservant les cellules contenant plus de 1000 gènes mais moins de 4000 gènes pour l’ensemble de données scRNA-seq et plus de 800, mais moins de 4000 gènes par noyau pour l’ensemble de données snRNA-seq. Exclure les ensembles de données, les cellules et les noyaux dépassant 5 % de lectures mitochondriales.
3. Pour atténuer les effets de lot entre les deux méthodes, intégrez les deux ensembles de données filtrés, normalisez et visualisez via l’approximation et la projection uniformes des variétés (UMAP). Omettre le groupe 1 qui affiche un faible nombre d’identificateurs moléculaires uniques (UMI) et de gènes. Ensuite, pour les grappes, attribuez des identités cellulaires basées sur des gènes marqueurs connus et l’ensemble de données organoïdes vieux de 30 jours d’Ana Uzquiano et. al. (Fichier de codage supplémentaire 1)¹⁸.

Résultats

Pour étudier la composition cellulaire des organoïdes cérébraux à l’aide du scRNA-seq et du snRNA-seq, les organoïdes cérébraux ont été récoltés après 30 jours de culture, car les organoïdes à ce stade présentent déjà des boucles neuroépithéliales composées de progéniteurs entourés de progéniteurs intermédiaires et de neurones à un stade précoce ^4,18. Le suivi de la qualité des organoïdes tout au long de la croissance et de la cultu...

Discussion

L’analyse transcriptomique de cellules uniques et de noyaux uniques est apparue comme un outil essentiel pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes dans les tissus complexes. Les deux méthodes permettent d’étudier le transcriptome des organoïdes cérébraux. Pour garantir le succès global de l’expérience, la qualité du matériau de départ est d’une grande importance. Par conséquent, il est nécessaire de couper régulièrement les organoïdes pour éviter la formation d’un noyau nécrotiq...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005