АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы представляем комплексный протокол для генерации и последующего анализа органоидов человеческого мозга с использованием секвенирования одиночных клеток и одноядерных РНК.

Аннотация

За последнее десятилетие транскриптомика одиночных клеток значительно эволюционировала и стала стандартным лабораторным методом для одновременного анализа профилей экспрессии генов отдельных клеток, позволяющим улавливать клеточное разнообразие. Для преодоления ограничений, связанных с трудно изолируемыми типами клеток, для секвенирования может быть использован альтернативный подход, направленный на восстановление отдельных ядер вместо интактных клеток, что делает транскриптомное профилирование отдельных клеток универсально применимым. Эти методы стали краеугольным камнем в изучении органоидов мозга, установив их в качестве моделей развивающегося человеческого мозга. Используя потенциал одноклеточной и одноядерной транскриптомики в исследованиях органоидов мозга, этот протокол представляет собой пошаговое руководство, охватывающее ключевые процедуры, такие как диссоциация органоидов, выделение одиночных клеток или ядер, подготовка библиотеки и секвенирование. Реализуя эти альтернативные подходы, исследователи могут получить высококачественные наборы данных, позволяющие идентифицировать типы нейронных и ненейрональных клеток, профили экспрессии генов и траектории клеточной линии. Это способствует всестороннему исследованию клеточных процессов и молекулярных механизмов, формирующих развитие мозга.

Введение

В последние годы органоидные технологии стали перспективным инструментом для культивирования органоподобных тканей 1,2,3. Особенно для органов, которые не могут быть легко доступны, таких как человеческий мозг, органоиды дают возможность получить представление о развитиии проявлении болезней. Таким образом, органоиды мозга широко используются в качестве экспериментальной модели для исследования различных расстройств мозга человека, включая заболевания развития, психиатрические или даже нейродегенеративныезаболевания.

С появлением технологий профилирования транскриптома одиночных клеток, первичные ткани человека и сложные модели in vitro стали изучаться с беспрецедентным уровнем детализации, что позволяет получить механистическое представление об изменениях экспрессии генов на уровне клеточных субпопуляций в норме и при заболеваниях и получить информацию о новых предполагаемых терапевтических мишенях 7,8,9. Развитие органоидной области было достигнуто за счет использования профилирования транскриптома одиночных клеток для оценки клеточного состава, воспроизводимости и точности технологий органоидов мозга 10,11,12. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) позволило классифицировать клетки и выявить генетическую дисрегуляцию в больных органоидах13,14. Важно отметить, что именно сложность органоидных тканей обуславливает необходимость внедрения методов, позволяющих профилировать отдельные клетки. Характеристика органоидов с помощью таких методов, как объемное профилирование транскриптома (объемное секвенирование РНК), приводит к маскировке клеточной гетерогенности и профилям экспрессии генов, которые усредняются по всем типам клеток в сложной ткани, что в конечном итоге ограничивает наше понимание текущих процессов во время развития органоидов в здоровом и больномсостоянии 15,16,17. По мере того, как методы scRNA-seq продолжают развиваться, создается все большее число атласов, примером которых являются такие ресурсы, как Атлас мозга Аллена или Атлас органоидов человеческого мозга с одиночными клетками Uzquiano et al.18.

Успешное получение scRNA-seq из органоидов мозга зависит от эффективной изоляции и захвата интактных клеток. Поскольку диссоциация органоидов мозга с получением отдельных клеток основана на ферментативном пищеварении, она может влиять на паттерны экспрессии генов, вызывая стресси повреждение клеток. Следовательно, диссоциация ткани на отдельные клетки является наиболее важным шагом. Альтернативным подходом является одноядерное секвенирование РНК (snRNA-seq), которое способствует экстракции ядер без ферментов как из свежей, так и из замороженной ткани21,22. Однако выделение ядер из ткани сопряжено с другими проблемами, такими как обогащение представляющих интерес типов клеток и низкое содержание РНК в ядрах по сравнению с клетками.

Транскриптомные исследования органоидов головного мозга обычно проводятся с использованием scRNA-seq 10,18,23. Тем не менее, выделение одиночных ядер может обеспечить ортогональный и дополнительный метод для исследования транскриптомного профиля органоидов. В этой статье мы представляем набор инструментов для scRNA- и snRNA-seq для органоидов мозга и обсуждаем критические моменты для получения данных секвенирования наилучшего качества.

протокол

Описанный протокол выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1 Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (номер одобрения: 138/08), в соответствии с требованиями и в соответствии с правилами ЕС и национальными правилами этики в исследованиях.

1. Получение органоидов переднего мозга из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

Примечание: Этот протокол был протестирован для нескольких различных линий iPSC, культивируемых в различных средах стволовых клеток от разных компаний (Таблица 1). Генерация органоидов переднего мозга в значительной степени зависит от высокого качества иПСК и их конфлюации на 60-70% до начала протокола. Здесь мы использовали коммерчески доступную линию клеток (см. Таблицу материалов).

  1. День 0: Формирование эмбриоидного тела
    1. Для обработки 96-луночного планшета плуроновым раствором добавьте 80 мкл стерильного фильтрованного 2% плуронового раствора на лунку 96-луночного U-образного планшета. Инкубировать не менее 15 минут при комнатной температуре (RT) или 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плуроновые обработанные пластины можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель и использовать их непосредственно без каких-либо этапов промывки для формирования эмбриоидного тела.
    2. Удаляйте плуроновый раствор из каждой лунки с помощью аспиратора или многоканальной пипетки перед посевом клеток.
    3. Перед началом работы приготовьте следующие реагенты для одного 96-луночного планшета: центрифужная пробирка объемом 15 мл с 5 мл предварительно подогретой среды DMEM: F12; 11 мл среды стволовых клеток с добавлением 50 мкМ Y-27632, обработанная плуроновой пластиной (как описано выше).
    4. Аспиратная среда из одной лунки 6-луночного планшета с 60-70% конфлюентными иПСК. Один раз промойте камеры с помощью PBS. Добавьте 500 μл реагента на основе трипсина и инкубируйте в течение 2-6 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для правильной отслойки клеток с реагентом на основе трипсина зависит от плотности клеток и адгезивных свойств клеточного матрикса каждой линии iPSC. Во избежание переваривания рекомендуется исследовать морфологию клеток после 2 минут инкубации с реагентом на основе трипсина с помощью микроскопа с использованием яркого поля.
    5. Отделите ячейки с помощью пипетки объемом 1000 мкл и перенесите в предварительно подготовленную центрифужную пробирку объемом 15 мл со средой DMEM:F12, чтобы остановить диссоциацию.
    6. Центрифужная суспензия ячеек в течение 3 мин при 300 x g. Аспиратируйте надосадочную жидкость и сохраняйте клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 1 мл среды для стволовых клеток с добавлением 50 мкМ Y-27632.
    7. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и добавьте желаемое количество клеток в среду для стволовых клеток с добавлением 50 μM Y-27632. Для создания одного эмбриоидного тела требуется 3000-12000 клеток в зависимости от клеточной линии.
    8. Перенесите клеточную суспензию в многоканальный резервуар для реагентов с помощью пипетки объемом 10 мл. С помощью многоканальной пипетки поместите 100 мкл/лунку клеточной суспензии в предварительно обработанный плюроником 96-луночный планшет.
    9. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C, 5%O2 и 5%CO2. Чтобы избежать каких-либо нарушений во время формирования эмбриоидного тела, воздержитесь от перемещения пластины.
  2. День 2: Обследование эмбриоидного тела
    1. Исследуйте образование эмбриоидного тела с помощью объектива 10-кратного увеличения яркопольного микроскопа. Эмбриоидные тельца должны иметь четкие края и минимальную гибель клеток.
    2. Отсадите как можно больше среды и замените ее на 100 μл/лунку среды стволовых клеток. (Критический) Эмбриоидные тельца легко удаляются из лунки при обмене среды. Следите за тем, чтобы не удалять их, поэтому следите за средой после аспирации.
  3. День 3: Индукция нейроэктодермы
    1. Отберите как можно больше среды и замените ее на 120 мкл/лунку индукционной среды и поместите пластину при температуре 37 °C, 20%O2 и 5%CO2.
  4. День 6: Встраивание
    1. В зависимости от линии iPSC, требуется 3 или 4 дня, чтобы вызвать появление нейроэктодермы. Регулярно контролируйте эмбриоидные тела. Как только края становятся яркими, эмбриоидные тела готовы к встраиванию. Используйте один из двух различных методов, которые могут быть использованы для встраивания эмбриоидного тела, как описано ниже24.
    2. Способ встраивания 1: Встраивание файлов cookie
      1. Разморозьте аликвоту неразбавленного геля внеклеточного матрикса на льду в течение 1-2 ч. (Критическое) Всегда держите гель внеклеточного матрикса на льду, чтобы предотвратить его затвердевание. Подготовьте аликвоты заранее, чтобы свести к минимуму время размораживания и повторные циклы размораживания.
      2. Разрежьте кончик пипетки объемом 200 мкл с помощью кусачек-когтей и соберите 16-32 эмбриоидных тела в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      3. Перенесите эмбриоидные тельца в 67 мкл среды в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 100 μL геля из внеклеточного матрикса с помощью разрезанного наконечника пипетки объемом 200 μL и аккуратно перемешайте.
      4. Равномерно распределите эмбриоидные тела в чашке диаметром 6 см и поставьте тарелку на 5-10 минут, чтобы гель внеклеточного матрикса застыл.
      5. Добавьте около 4 мл дифференцировочной среды и инкубируйте при 37 °C, 20%O2 и 5%CO2. На следующий день поставьте тарелку на орбитальный шейкер (84 оборота в минуту). Следите за тем, чтобы все эмбриоидные тела отделились от дна. Если нет, аккуратно отсоедините их с помощью отрезанного наконечника пипетки и фильтрующего материала.
    3. Метод встраивания 2: Встраивание жидкости
      1. Разморозьте аликвоту неразбавленного геля внеклеточного матрикса на льду в течение 1-2 ч и поместите на лед дифференцировочную среду. (Критический) При добавлении геля с внеклеточным матриксом среда должна быть ледяной.
      2. Как только среда остынет, добавьте гель с внеклеточным матриксом до конечной концентрации 2%. Разрежьте кончик пипетки объемом 200 мкл с помощью кулачковых кусачек и перенесите до 24 эмбриоидных тел в одну лунку 6-луночного планшета.
      3. Удалите все излишки среды и добавьте около 4 мл 2% геля/дифференцировочной среды внеклеточного матрикса в одну лунку 6-луночного планшета. Немедленно поместите пластину на орбитальный шейкер (84 об/мин).
  5. День 9-20: Проводите полный медиаобмен с использованием дифференцированных медиа каждые 3-4 дня.
  6. День 21-30: Перенесите органоиды в среды созревания и выполняйте полный обмен средами каждые 3-4 дня.
  7. Диссоциация органоидов: Для диссоциации отдельных ядер и клеток используйте органоиды высокого качества. Чтобы избежать чрезмерной гибели клеток, регулярно разрезайте органоиды, чтобы предотвратить накопление некротического ядра, и дайте им восстановиться в течение 2 недель, прежде чем диссоциировать их для дальнейшего анализа.

2. Получение одиночной клетки из органоидов

Примечание: Диссоциация одиночных клеток выполняется с помощью набора для диссоциации нервной ткани (Таблица 2), в котором используется механическая и ферментативная диссоциация. Здесь мы опишем ручную механическую диссоциацию. В качестве альтернативы можно использовать машину для диссоциации.

  1. Приготовьте раствор СТОП и 0,04% БСА на льду. Приготовьте смесь ферментов 1 и 2 и 0,04% BSA в PBS и положите на лед.
  2. Соберите до 5 органоидов в одну лунку 6-луночного планшета, отсадите излишки среды и промойте один раз PBS для удаления питательных сред. Поместите органоиды в середину лунки и с помощью скальпеля тщательно измельчите органоиды.
  3. Добавьте смесь ферментов 1 и поместите при температуре 37 °C, 20%O2 и 5% CO2, встряхивая при 90 об/мин в течение 10-15 минут.
  4. С помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл ресуспендируйте органоиды путем пипетирования до 10 раз. Добавьте смесь ферментов 2 и хорошо перемешайте ее с помощью пипетирования с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл. Поместите при 37 °C, 20%O2 и 5% CO2, встряхивая при 90 об/мин в течение 10-15 минут.
  5. Остановите процесс диссоциации, повторно суспендировав раствор клетки в 10 мл холодного раствора STOP. Решение фильтрующей ячейки с использованием сетчатого фильтра 70 μM. Центрифугируйте отфильтрованный раствор в течение 10 минут при 300 x g при 4 °C до образования гранулы.
  6. Аспиратуйте среды, оставляя клеточную гранулу и ресуспендируя клетки в 4 мл холода 0,04% БСА. Решение фильтрующей ячейки с помощью сетчатого фильтра для клеток 40 мкМ и подсчет ячеек с помощью счетчика ячеек.
  7. Центрифугируйте раствор ячейки в течение 10 мин при 300 x g при 4 °C. Аспират раствор БСА, оставляя клеточную гранулу. Ресуспензируйте клетки в соответствии с инструкцией по набору snRNA-seq на основе микрофлюидики в среде NSB+.

3. Выделение одиночных ядер из органоидов

  1. Переложите органоиды в охлажденный PBS и разрежьте каждый органоид на 4 части. Промойте органоиды 2 раза охлажденным PBS.
  2. Разрежьте ножницами кончик пипетки объемом 1000 мкл и перенесите кусочки органоида в дончик объемом 2 мл. Полностью отсадите PBS и добавьте 1 мл буфера для лизиса NP40.
  3. Переложите суспензию 3 раза с помощью пестика А и 3 раза с помощью пестика В. Перенесите суспензию в пробирку для центрифуги объемом 15 мл. Промойте выдувку еще 1 мл буфера для лизиса NP40 и переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Инкубировать в течение 5 мин при РТ, а затем центрифугировать суспензию в течение 5 мин при 500 x g.
  4. Асасируйте надосадочную жидкость, оставляя 50 μл надосадочной жидкости. Добавьте 1 мл NSB+, не потревожив гранулы. Восстановите суспензию через 5 минут инкубации.
  5. Слой суспензии поверх градиента Percoll (нижний слой: 1 мл NSB+ и 250 μL Percoll, средний слой: 1 мл NSB+ и 188 μL Percoll, верхний слой: 1 мл NSB+ и 125 μL Percoll). (Критический) Выполняйте наслоение очень осторожно, чтобы избежать смешивания слоев.
  6. Центрифугировать в течение 5 мин при 500 x g при 4 °C, отсадить надосадочную жидкость и ресуспендировать в NSB+. Отфильтруйте раствор ядер с помощью клеточного фильтра 40 μM.
  7. Окрашивание и подсчет ядер с помощью DAPI и камеры Нейбауэра. Ресуспендируйте ядра в соответствии с руководством по набору scRNA-seq на основе микрофлюидики.

4. Подготовка библиотеки и секвенирование

  1. Загрузите 10 000 клеток и ядер в микрофлюидную систему и сгенерируйте библиотеку в соответствии с руководством по набору scRNA-seq на основе микрофлюидики (Table of Materials).
  2. Секвенирование библиотек с расчетным количеством 6 x 108 прочтений на библиотеку snRNA-seq и 1,6 x 108 прочтений на библиотеку scRNA-seq, что приведет к насыщению секвенирования на уровне 87% для набора данных snRNA-seq и 36% насыщения секвенирования для набора данных scRNA-seq.

5. Анализ

  1. Проведите анализ секвенирования с помощью конвейера анализа данных для scRNA-seq и snRNA-seq и сопоставьте их с геномом человека GRCh38. Подвергните матрицу счетчиков, сгенерированную этим конвейером, дальнейшему анализу с помощью R-пакета Seurat (Version 4.1.1)25.
  2. Создайте объект Сёра, рассмотрев гены, которые были представлены не менее чем в 5 клетках, и включив в него клетки, содержащие не менее 300 генов. Выполняйте дополнительную фильтрацию контроля качества, сохраняя клетки, которые содержали более 1000 генов, но менее 4000 генов для набора данных scRNA-seq и более 800, но менее 4000 генов на ядро для набора данных snRNA-seq. Исключите наборы данных, клетки и ядра, превышающие 5% митохондриальных прочтений.
  3. Чтобы смягчить пакетные эффекты между обоими методами, интегрируйте оба отфильтрованных набора данных, нормализуйте и визуализируйте с помощью равномерной аппроксимации и проекции многообразия (UMAP). Исключите кластер 1, который показывает низкий уникальный молекулярный идентификатор (UMI) и количество генов. Впоследствии, для кластеров присваиваются идентичности клеток на основе известных маркерных генов и набора органоидов 30-дневной давности от Ana Uzquiano et. al. (Файл дополнительного кодирования 1)18.

Результаты

Для исследования клеточного состава органоидов головного мозга с использованием scRNA-seq и snRNA-seq органоиды мозга были собраны после 30 дней культивирования, поскольку органоиды на этой стадии уже демонстрируют нейроэпителиальные петли, состоящие из предшественников, окруженных промежут...

Обсуждение

Транскриптомный анализ отдельных клеток и отдельных ядер стал ключевым инструментом для понимания механизмов регуляции генов в сложных тканях. Оба метода позволяют проводить транскриптомные исследования органоидов мозга. Для обеспечения общего успеха эксперимента большое значение...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Благодарим Валерию Фернандес-Валлоне за оригинальную инструкцию к набору Miltenyi Neural Dissociation. Мы также благодарим технологическую платформу геномики Центра Макса Дельбрюка за предоставленный рецепт буфера для лизиса NP40 и ценные советы по настройке этого протокола. Мы также благодарим Маргарету Херцог и Александру Чернычев за организационную поддержку лаборатории.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

Ссылки

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены