Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren hat sich die Einzelzell-Transkriptomik erheblich weiterentwickelt und ist zu einer Standardlabormethode für die gleichzeitige Analyse von Genexpressionsprofilen einzelner Zellen geworden, die die Erfassung der zellulären Vielfalt ermöglicht. Um die Einschränkungen durch schwer zu isolierende Zelltypen zu überwinden, kann für die Sequenzierung ein alternativer Ansatz verwendet werden, der darauf abzielt, einzelne Zellkerne anstelle von intakten Zellen zu gewinnen, wodurch das Transkriptom-Profiling einzelner Zellen universell anwendbar wird. Diese Techniken sind zu einem Eckpfeiler in der Erforschung von Gehirnorganoiden geworden und haben sie als Modelle des sich entwickelnden menschlichen Gehirns etabliert. Dieses Protokoll nutzt das Potenzial der Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomik in der Hirn-Organoidforschung und stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung dar, die wichtige Verfahren wie Organoid-Dissoziation, Einzelzell- oder Zellkernisolierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung umfasst. Durch die Implementierung dieser alternativen Ansätze können Forscher qualitativ hochwertige Datensätze erhalten, die die Identifizierung neuronaler und nicht-neuronaler Zelltypen, Genexpressionsprofile und Zelllinienverläufe ermöglichen. Dies ermöglicht umfassende Untersuchungen zellulärer Prozesse und molekularer Mechanismen, die die Entwicklung des Gehirns prägen.

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich Organoidtechnologien als vielversprechendes Werkzeug für die Kultivierung organähnlicher Gewebe erwiesen ^1,2,3. Gerade für Organe, die nicht leicht zugänglich sind, wie z.B. das menschliche Gehirn, bieten Organoide die Möglichkeit, Einblicke in die Entstehung und Krankheitsmanifestation zu gewinnen⁴. Daher wurden Gehirnorganoide häufig als experimentelles Modell zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen des menschlichen Gehirns verwendet, einschließlich Entwicklungs-, psychiatrischer oder sogar neurodegenerativer Erkr....

Protokoll

Das beschriebene Protokoll wird in einem Labor der Biosicherheitsstufe 1 des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin (Zulassungsnummer: 138/08) in Übereinstimmung mit den Anforderungen und in Übereinstimmung mit den EU- und nationalen Vorschriften zur Ethik in der Forschung durchgeführt.

1. Gewinnung von Vorderhirn-Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an mehreren verschiedenen iPS-Linien getestet, die in einer Vielzahl von Stammzellmedien verschiedener Unternehmen kultiviert wurden (Tabelle 1). Die Erzeugung von Vorderhir....

Diskussion

Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen und einzelner Zellkerne hat sich zu einem zentralen Werkzeug für das Verständnis der genregulatorischen Mechanismen in komplexen Geweben entwickelt. Beide Methoden ermöglichen Transkriptom-Untersuchungen von Hirnorganoiden. Um einen insgesamt erfolgreichen Versuch zu gewährleisten, ist die Qualität des Ausgangsmaterials von hoher Relevanz. Daher ist es notwendig, die Organoide regelmäßig zu schneiden, um die Bildung eines nekrotischen Kerns^{zu verhind.......}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005