Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren hat sich die Einzelzell-Transkriptomik erheblich weiterentwickelt und ist zu einer Standardlabormethode für die gleichzeitige Analyse von Genexpressionsprofilen einzelner Zellen geworden, die die Erfassung der zellulären Vielfalt ermöglicht. Um die Einschränkungen durch schwer zu isolierende Zelltypen zu überwinden, kann für die Sequenzierung ein alternativer Ansatz verwendet werden, der darauf abzielt, einzelne Zellkerne anstelle von intakten Zellen zu gewinnen, wodurch das Transkriptom-Profiling einzelner Zellen universell anwendbar wird. Diese Techniken sind zu einem Eckpfeiler in der Erforschung von Gehirnorganoiden geworden und haben sie als Modelle des sich entwickelnden menschlichen Gehirns etabliert. Dieses Protokoll nutzt das Potenzial der Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomik in der Hirn-Organoidforschung und stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung dar, die wichtige Verfahren wie Organoid-Dissoziation, Einzelzell- oder Zellkernisolierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung umfasst. Durch die Implementierung dieser alternativen Ansätze können Forscher qualitativ hochwertige Datensätze erhalten, die die Identifizierung neuronaler und nicht-neuronaler Zelltypen, Genexpressionsprofile und Zelllinienverläufe ermöglichen. Dies ermöglicht umfassende Untersuchungen zellulärer Prozesse und molekularer Mechanismen, die die Entwicklung des Gehirns prägen.

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich Organoidtechnologien als vielversprechendes Werkzeug für die Kultivierung organähnlicher Gewebe erwiesen ^1,2,3. Gerade für Organe, die nicht leicht zugänglich sind, wie z.B. das menschliche Gehirn, bieten Organoide die Möglichkeit, Einblicke in die Entstehung und Krankheitsmanifestation zu gewinnen⁴. Daher wurden Gehirnorganoide häufig als experimentelles Modell zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen des menschlichen Gehirns verwendet, einschließlich Entwicklungs-, psychiatrischer oder sogar neurodegenerativer Erkrankungen ^4,5,6.

Mit dem Aufkommen von Einzelzell-Transkriptom-Profiling-Technologien konnten primäre menschliche Gewebe und komplexe In-vitro-Modelle mit einer noch nie dagewesenen Granularität untersucht werden, was mechanistische Einblicke in Genexpressionsänderungen auf der Ebene von Zellsubpopulationen bei Gesundheit und Krankheit lieferte und über neue mögliche therapeutische Ziele informierte ^7,8,9. Das Organoid-Feld hat sich weiterentwickelt, indem Einzelzell-Transkriptom-Profiling verwendet wurde, um die zelluläre Zusammensetzung, Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit von Organoid-Technologien im Gehirn zu beurteilen 10,11,12. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglichte die Zellklassifikation und die Identifizierung genetischer Dysregulation in erkrankten Organoiden^13,14. Wichtig ist, dass die Komplexität von organoiden Geweben die Implementierung von Techniken erfordert, die die Profilerstellung einzelner Zellen ermöglichen. Die Charakterisierung von Organoiden mit Methoden wie dem Bulk Transcriptome Profiling (Bulk RNA Sequencing) führt zu maskierten zellulären Heterogenitäts- und Genexpressionsprofilen, die über alle Zelltypen innerhalb des komplexen Gewebes gemittelt werden, was letztendlich unser Verständnis der ablaufenden Prozesse während der Organoidentwicklung in Gesundheit und Krankheit einschränkt 15,16,17 . Mit der Weiterentwicklung der scRNA-seq-Methoden wird eine zunehmende Anzahl von Atlanten erstellt, wie z. B. der Allen Brain Atlas oder der Single cell atlas of human brain organoids von Uzquiano et ^al.18.

Die erfolgreiche Durchführung von scRNA-seq aus Gehirnorganoiden hängt von der effektiven Isolierung und dem Einfangen intakter Zellen ab. Da die Dissoziation von Gehirnorganoiden zur Gewinnung einzelner Zellen auf enzymatischer Verdauung basiert, kann sie die Genexpressionsmuster beeinflussen, indem sie Stress und Zellschäden induziert^19,20. Daher ist die Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen der wichtigste Schritt. Ein alternativer Ansatz ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), die die enzymfreie Extraktion von Zellkernen sowohl aus frischem als auch aus gefrorenem Gewebe ermöglicht^21,22. Die Isolierung von Zellkernen aus einem Gewebe bringt jedoch weitere Herausforderungen mit sich, wie z. B. die Anreicherung von Zelltypen von Interesse und den geringen RNA-Gehalt von Zellkernen im Vergleich zu Zellen.

Transkriptomstudien an Gehirnorganoiden werden häufig mit scRNA-seq 10,18,23 durchgeführt. Die Isolierung einzelner Kerne könnte jedoch eine orthogonale und ergänzende Methode zur Untersuchung des transkriptomischen Profils von Organoiden darstellen. Hier stellen wir eine Toolbox für scRNA- und snRNA-seq für Hirnorganoide vor und diskutieren die kritischen Punkte, um die besten Sequenzierungsdaten zu erhalten.

Protokoll

Das beschriebene Protokoll wird in einem Labor der Biosicherheitsstufe 1 des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin (Zulassungsnummer: 138/08) in Übereinstimmung mit den Anforderungen und in Übereinstimmung mit den EU- und nationalen Vorschriften zur Ethik in der Forschung durchgeführt.

1. Gewinnung von Vorderhirn-Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an mehreren verschiedenen iPS-Linien getestet, die in einer Vielzahl von Stammzellmedien verschiedener Unternehmen kultiviert wurden (Tabelle 1). Die Erzeugung von Vorderhirn-Organoiden hängt stark von qualitativ hochwertigen iPS-Zellen und einer Konfluenz von 60%-70% vor Beginn des Protokolls ab. Hier haben wir eine kommerziell erhältliche Zelllinie verwendet (siehe Materialtabelle).

1. Tag 0: Bildung des embryoiden Körpers
   1. Für die Behandlung einer 96-Well-Platte mit pluronischer Lösung fügen Sie 80 μl steril gefilterte 2%ige pluronische Lösung pro Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte hinzu. Mindestens 15 min bei Raumtemperatur (RT) oder 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Mit Pluronic behandelte Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden und können ohne Waschschritte direkt für die Bildung von Embryoidkörpern verwendet werden.
   2. Entfernen Sie die pluronische Lösung aus jeder Vertiefung mit einem Aspirator oder einer Mehrkanalpipette, bevor Sie die Zellen aussäen.
   3. Bereiten Sie vor dem Start die folgenden Reagenzien für eine 96-Well-Platte vor: 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 mL vorgewärmtem DMEM: F12-Medium; 11 ml Stammzellmedium, ergänzt mit 50 μM Y-27632, pluronisch behandelte Platte (wie oben beschrieben).
   4. Aspirieren Sie Medien aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 60-70 % konfluenten iPSCs. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. 500 μl Reagenz auf Trypsinbasis zugeben und 2-6 min bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit für die korrekte Ablösung von Zellen mit einem Reagenz auf Trypsinbasis hängt von der Zelldichte und den zellmatrixadhäsiven Eigenschaften jeder iPSC-Linie ab. Um eine Überverdauung zu vermeiden, wird empfohlen, die Zellmorphologie nach 2 Minuten Inkubation mit einem Reagenz auf Trypsinbasis mit einem Hellfeldmikroskop zu untersuchen.
   5. Nehmen Sie die Zellen mit einer 1000-μl-Pipette ab und geben Sie sie in das zuvor vorbereitete 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit DMEM:F12-Medium, um die Dissoziation zu stoppen.
   6. Zentrifugenzellensuspension für 3 min bei 300 x g. Überstand aspirieren und Zellpellet aufbewahren. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml Stammzellmedium, das mit 50 μM Y-27632 ergänzt ist.
   7. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler und geben Sie die gewünschte Anzahl von Zellen zu den Stammzellmedien, die mit 50 μM Y-27632 ergänzt sind. Für die Erzeugung eines einzelnen Embryoidkörpers werden je nach Zelllinie 3.000 bis 12.000 Zellen benötigt.
   8. Übertragen Sie die Zellsuspension mit einer 10-ml-Pipette in ein Mehrkanal-Reagenzreservoir. Mit einer Mehrkanalpipette 100 μl/Well der Zellsuspension in die zuvor mit Pluronik behandelte 96-Well-Platte einfüllen.
   9. Die 96-Well-Platte bei 37 °C, 5 % O₂ und 5 % CO₂ in einen Inkubator stellen. Um Störungen während der Körperbildung von Embryoiden zu vermeiden, sollten Sie die Platte nicht bewegen.
2. Tag 2: Untersuchung der Embryoidkörperbildung
   1. Untersuchen Sie die Körperbildung von Embryoiden mit einem 10-fach-Objektiv eines Hellfeldmikroskops. Embryoidkörper sollten klare Kanten und minimalen Zelltod aufweisen.
   2. Aspirieren Sie so viel Medium wie möglich und ersetzen Sie es durch 100 μl/Vertiefung Stammzellmedium. (Kritisch) Embryoidkörper lassen sich während des Medienaustauschs leicht aus der Vertiefung entfernen. Achten Sie darauf, sie nicht zu entfernen, überwachen Sie daher das Medium nach der Aspiration.
3. Tag 3: Neuroektoderm-Induktion
   1. Saugen Sie so viel Medium wie möglich an und ersetzen Sie es durch 120 μl/Vertiefung Induktionsmedium und setzen Sie die Platte bei 37 °C, 20 % O₂ und 5 % CO₂ ein.
4. Tag 6: Einbettung
   1. Abhängig von der iPSC-Linie sind 3 oder 4 Tage erforderlich, um das Auftauchen des Neuroektoderms zu induzieren. Überwachen Sie die Embryoidkörper regelmäßig. Sobald die Ränder hell werden, sind die embryoiden Körper bereit für die Einbettung. Verwenden Sie eine der beiden verschiedenen Methoden, die für die Einbettung des Embryoidkörpers verwendet werden können, wie unten beschrieben²⁴.
   2. Einbettungsmethode 1: Einbettung von Cookies
      1. Tauen Sie ein Aliquot des unverdünnten extrazellulären Matrixgels 1-2 Stunden lang auf Eis auf. (Kritisch) Bewahren Sie extrazelluläres Matrixgel immer auf Eis auf, um eine Verfestigung zu verhindern. Bereiten Sie Aliquote im Voraus vor, um die Auftauzeit und wiederholte Auftauzyklen zu minimieren.
      2. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipette mit einer Krallenzange ab und sammeln Sie 16-32 Embryoidkörper in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. Übertragen Sie die Embryoidkörper in 67 μl des Mediums in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. 100 μl extrazelluläres Matrixgel mit einer abgeschnittenen 200 μl Pipettenspitze zugeben und vorsichtig mischen.
      4. Verteilen Sie die Embryoidkörper gleichmäßig in einer 6 cm großen Schale und stellen Sie die Platte für 5-10 Minuten auf, damit sich das extrazelluläre Matrixgel verfestigen kann.
      5. Etwa 4 ml Differenzierungsmedium zugeben und bei 37 °C, 20 % O₂ und 5 % CO₂ inkubieren. Stellen Sie die Schale am nächsten Tag auf einen Orbitalschüttler (84 U/min). Stellen Sie sicher, dass sich alle embryoiden Körper von der Unterseite lösen. Wenn nicht, verwenden Sie eine abgeschnittene Pipettenspitze und ein abgeschnittenes Medium, um sie vorsichtig zu lösen.
   3. Einbettungsmethode 2: Flüssiges Einbetten
      1. Tauen Sie ein Aliquot des unverdünnten extrazellulären Matrixgels 1-2 h auf Eis auf und legen Sie das Differenzierungsmedium auf Eis. (Kritisch) Das Medium muss eiskalt sein, wenn extrazelluläres Matrixgel hinzugefügt wird.
      2. Sobald das Medium kalt ist, fügen Sie extrazelluläres Matrixgel bis zur Endkonzentration von 2% hinzu. Schneiden Sie die Spitze einer 200-μl-Pipette mit einer Krallenzange ab und übertragen Sie bis zu 24 Embryoidkörper in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
      3. Entfernen Sie alle überschüssigen Medien und geben Sie etwa 4 ml 2% extrazelluläres Matrixgel/Differenzierungsmedium in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Stellen Sie die Platte sofort auf den Orbitalschüttler (84 U/min).
5. Tag 9-20: Führen Sie alle 3-4 Tage einen vollständigen Medienaustausch mit Differenzierungsmedien durch.
6. Tag 21-30: Übertragen Sie die Organoide in das Reifungsmedium und führen Sie alle 3-4 Tage einen vollständigen Medienaustausch durch.
7. Dissoziation von Organoiden: Verwenden Sie für die Dissoziation von Einzelkernen und Zellen Organoide von hoher Qualität. Um übermäßige Mengen an Zelltod zu vermeiden, schneiden Sie die Organoide regelmäßig ab, um die Bildung eines nekrotischen Kerns zu verhindern, und lassen Sie sie sich 2 Wochen lang erholen, bevor Sie sie für die weitere Analyse dissoziieren.

2. Ableitung einer Einzelzelle aus Organoiden

HINWEIS: Die Einzelzelldissoziation wird mit dem Neural Tissue Dissociation Kit (Tabelle 2) durchgeführt, das eine mechanische und enzymatische Dissoziation verwendet. Hier beschreiben wir eine manuelle mechanische Dissoziation. Alternativ kann eine Dissoziationsmaschine verwendet werden.

1. Bereiten Sie die STOP-Lösung und 0,04 % BSA auf Eis vor. Enzymmischung 1 und 2 und 0,04% BSA in PBS zubereiten und auf Eis legen.
2. Sammeln Sie bis zu 5 Organoide in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte, aspirieren Sie überschüssige Medien und waschen Sie sie einmal mit PBS, um das Kulturmedium zu entfernen. Organoide in die Mitte der Vertiefung legen und mit einem Skalpell die Organoide gründlich zerkleinern.
3. Enzymmix 1 zugeben und bei 37 °C, 20 % O₂ und 5 % CO₂ 10-15 min bei 90 U/min schütteln.
4. Mit einer 1000-μl-Pipettenspitze können Sie Organoide resuspendieren, indem Sie bis zu 10x pipettieren. Fügen Sie die Enzymmischung 2 hinzu und mischen Sie sie gut, indem Sie sie mit einer 1000-μl-Pipettenspitze pipettieren. Bei 37 °C, 20 % O₂ und 5 % CO₂ unter 10-15 min bei 90 U/min schütteln.
5. Stoppen Sie den Dissoziationsprozess, indem Sie die Zelllösung in 10 ml kalter STOP-Lösung resuspendieren. Filtrieren Sie die Zelllösung mit einem 70 μM Zellsieb. Die filtrierte Zelllösung 10 min bei 300 x g bei 4 °C zentrifugieren, um ein Pellet zu bilden.
6. Aspirieren Sie das Medium, hinterlassen Sie ein Zellpellet und resuspendieren Sie die Zellen in 4 ml kaltem 0,04 % BSA. Filtrieren Sie die Zelllösung mit einem 40 μM Zellsieb und zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler.
7. Die Zelllösung wird 10 min lang bei 300 x g bei 4 °C zentrifugiert. Aspirieren Sie die BSA-Lösung, wobei ein Zellpellet übrig bleibt. Resuspendieren Sie Zellen gemäß einem mikrofluidikbasierten snRNA-seq-Kit-Handbuch im NSB+-Medium.

3. Isolierung einzelner Zellkerne aus Organoiden

1. Organoide in gekühltes PBS überführen und jedes Organoid in 4 Stücke schneiden. Organoide 2x mit gekühltem PBS waschen.
2. Schneiden Sie mit einer Schere die Pipettenspitze einer 1000 μL Pipette ab und geben Sie Organoidstücke in einen 2 mL Douncer. Aspirieren Sie PBS vollständig und fügen Sie 1 ml NP40-Lysepuffer hinzu.
3. 3x mit Stößel A und 3x mit Stößel B übergehen. Suspension in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Douncer mit zusätzlich 1 mL NP40 Lysepuffer waschen und in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. 5 min bei RT inkubieren und anschließend die Suspension 5 min bei 500 x g zentrifugieren .
4. Überstand aspirieren, wobei 50 μl Überstand zurückbleiben. Fügen Sie 1 ml NSB+ hinzu, ohne das Pellet zu stören. Nach 5 Minuten Inkubation wieder suspendieren.
5. Schichtsuspension auf einem Percoll-Gradienten (untere Schicht: 1 mL NSB+ und 250 μl Percoll, mittlere Schicht: 1 mL NSB+ und 188 μl Percoll, obere Schicht: 1 mL NSB+ und 125 μl Percoll). (Kritisch) Führen Sie die Schichtung sehr sorgfältig durch, um eine Vermischung der Schichten zu vermeiden.
6. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren, Überstand aspirieren und in NSB+ resuspendieren. Filtrieren Sie die Kernlösung mit einem 40 μM Zellsieb.
7. Färben und Zählen von Kernen mit DAPI und einer Neubauer-Kammer. Resuspendieren Sie Zellkerne gemäß einem mikrofluidikbasierten scRNA-seq-Kit-Handbuch.

4. Vorbereitung und Sequenzierung der Bibliothek

1. Laden Sie 10.000 Zellen und Zellkerne in ein Mikrofluidik-System und generieren Sie die Bibliothek gemäß dem Handbuch des mikrofluidikbasierten scRNA-seq-Kits (Table of Materials).
2. Sequenzieren Sie die Bibliotheken mit geschätzten 6 x 10⁸ Reads pro snRNA-seq-Bibliothek und 1,6 x 10⁸ Reads pro scRNA-seq-Bibliothek, was zu einer Sequenzierungssättigung von 87 % für den snRNA-seq-Datensatz und 36 % Sequenzierungssättigung für den scRNA-seq-Datensatz führt.

5. Analyse

1. Führen Sie die Analyse der Sequenzierung mit einer Datenanalyse-Pipeline für scRNA-seq und snRNA-seq durch und richten Sie sie mit dem menschlichen GRCh38-Genom ab. Prüfen Sie die von dieser Pipeline generierte Zählmatrix einer weiteren Analyse mit dem R-Paket Seurat (Version 4.1.1)²⁵.
2. Erstellen Sie das Seurat-Objekt, indem Sie Gene berücksichtigen, die in mindestens 5 Zellen vertreten waren, und Zellen integrieren, die mindestens 300 Gene enthalten. Führen Sie eine zusätzliche Qualitätskontrollfilterung durch, indem Sie Zellen zurückhalten, die mehr als 1000 Gene, aber weniger als 4000 Gene für den scRNA-seq-Datensatz und mehr als 800, aber weniger als 4000 Gene pro Zellkern für den snRNA-seq-Datensatz enthielten. Ausschließen von Datensätzen, Zellen und Zellkernen mit mehr als 5 % mitochondrialen Lesevorgängen.
3. Um Batch-Effekte zwischen beiden Methoden zu vermeiden, integrieren Sie beide gefilterten Datensätze, normalisieren und visualisieren Sie sie über Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP). Lassen Sie Cluster 1 aus, der einen niedrigen Unique Molecular Identifier (UMI) und eine niedrige Genanzahl aufweist. Anschließend werden für die Cluster Zellidentitäten basierend auf bekannten Markergenen und dem 30 Tage alten Organoid-Datensatz von Ana Uzquiano et. al. (Ergänzende Kodierungsdatei 1)¹⁸.

Ergebnisse

Um die Zelltypzusammensetzung von Hirnorganoiden mit scRNA-seq und snRNA-seq zu untersuchen, wurden Hirnorganoide nach 30-tägiger Kultur geerntet, da Organoide in diesem Stadium bereits neuroepitheliale Schleifen aufweisen, die aus Vorläufern bestehen, die von intermediären Vorläuferzellen und Neuronen im Frühstadium umgeben sind ^4,18. Die Überwachung der Qualität der Organoide während des gesamten Wachstums und der Kultivierung ist unerlässlich, um zuve...

Diskussion

Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen und einzelner Zellkerne hat sich zu einem zentralen Werkzeug für das Verständnis der genregulatorischen Mechanismen in komplexen Geweben entwickelt. Beide Methoden ermöglichen Transkriptom-Untersuchungen von Hirnorganoiden. Um einen insgesamt erfolgreichen Versuch zu gewährleisten, ist die Qualität des Ausgangsmaterials von hoher Relevanz. Daher ist es notwendig, die Organoide regelmäßig zu schneiden, um die Bildung eines nekrotischen Kerns^{zu verhind...}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005