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要約

ここでは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングを使用したヒト脳オルガノイドの生成およびダウンストリーム解析のための包括的なプロトコールを紹介します。

要約

過去10年間で、シングルセルトランスクリプトミクスは大幅に進化し、個々の細胞の遺伝子発現プロファイルを同時に解析するための標準的な実験室法となり、細胞の多様性を捉えることが可能になりました。単離が困難な細胞タイプによる制限を克服するために、無傷の細胞ではなく単一の核を回収することを目的とした別のアプローチをシーケンシングに利用することができ、個々の細胞のトランスクリプトームプロファイリングを普遍的に適用できます。これらの技術は、脳オルガノイドの研究の基礎となり、発達中のヒト脳のモデルとして確立されています。脳オルガノイド研究におけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトミクスの可能性を活用するこのプロトコルは、オルガノイドの解離、シングルセルまたは核の単離、ライブラリ調製、シーケンシングなどの主要な手順を網羅したステップバイステップのガイドを提供します。これらの代替アプローチを実装することで、研究者は高品質のデータセットを取得でき、ニューロン細胞と非ニューロン細胞のタイプ、遺伝子発現プロファイル、および細胞系統の軌跡を同定できます。これにより、脳の発達を形作る細胞プロセスと分子メカニズムの包括的な研究が容易になります。

概要

ここ数年で、オルガノイド技術は臓器様組織を培養するための有望なツールとして浮上してきました1,2,3。特に、人間の脳など、簡単にアクセスできない臓器の場合、オルガノイドは発生や疾患の発現に関する洞察を得る機会を提供します4。このように、脳オルガノイドは、発達疾患、精神疾患、さらには神経変性疾患など、さまざまなヒトの脳障害を調査するための実験モデルとして広く使用されてきました4,5,6。

シングルセルトランスクリプトームプロファイリング技術の出現により、初代ヒト組織や複雑なin vitroモデルを前例のない粒度で研究できるようになり、健康や疾患における細胞亜集団レベルでの遺伝子発現変化に関するメカニズム的な洞察が得られ、新たな推定治療標的に関する情報を得ることができるようになった7,8,9.オルガノイド分野は、脳オルガノイド技術10,11,12の細胞組成、再現性、および忠実度を評価するために、シングルセルトランスクリプトームプロファイリングを利用することによって進歩してきた。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)により、疾患オルガノイドの細胞分類と遺伝的調節不全の同定が可能になりました13,14。重要なことは、オルガノイド組織の複雑さが、個々の細胞のプロファイリングを可能にする技術の実装を必要とすることです。バルクトランスクリプトームプロファイリング(バルクRNAシーケンシング)などの方法を用いたオルガノイドの特性評価は、複雑な組織内のすべてのタイプの細胞で平均化されるマスクされた細胞の不均一性および遺伝子発現プロファイルをもたらし、最終的に健康および疾患におけるオルガノイド開発中の進行中のプロセスの理解を制限する15,16,17.scRNA-seq法が進歩し続けるにつれて、Allen Brain AtlasやUzquianoらによるヒト脳オルガノイドのシングルセルアトラスなどのリソースに代表されるように、ますます多くのアトラスが作成されています18。

脳オルガノイドからのscRNA-seqを成功させるには、無傷の細胞の効果的な単離と捕捉が必要です。個々の細胞を得るための脳オルガノイドの解離は酵素消化に基づいているため、ストレスや細胞損傷を誘発することにより遺伝子発現パターンに影響を与えることができる19,20。したがって、組織を個々の細胞に解離させることが最も重要なステップです。別のアプローチは、単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)であり、これは新鮮組織と凍結組織の両方から核を酵素なしで抽出することを容易にする21,22。しかし、組織からの核の単離には、目的の細胞の種類の濃縮や、細胞と比較して核のRNA含有量が低いなど、他の課題があります。

脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究は、一般的にscRNA-seq 10,18,23を用いて行われます。しかし、単一核の単離は、オルガノイドのトランスクリプトームプロファイルを調査するための直交的かつ補足的な方法を提供する可能性があります。ここでは、脳オルガノイド用のscRNA-seqおよびsnRNA-seqのツールボックスを紹介し、最高品質のシーケンシングデータを取得するための重要なポイントについて説明します。

プロトコル

記載されているプロトコルは、マックス・デルブリュック分子医学センター(承認番号:138/08)のバイオセーフティレベル1の研究室で、研究における倫理に関するEUおよび国内の規則および要件に従って実施されます。

1. 人工多能性幹細胞(iPSC)からの前脳オルガノイドの作製

注:このプロトコルは、さまざまな企業のさまざまな幹細胞培地で培養したいくつかの異なるiPSC株について試験しました(表1)。前脳オルガノイドの作製は、高品質のiPS細胞に大きく依存し、プロトコール開始前に60%〜70%のコンフルエンスが必要です。ここでは、市販の細胞株を使用しました( 材料の表を参照)。

  1. 0日目:胚様体形成
    1. 96ウェルプレートをプルロン酸溶液で処理するには、96ウェルU底プレートのウェルあたり80 μLの滅菌ろ過済み2%プルロン酸溶液を添加します。室温(RT)または37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。
      注:プルロニック処理プレートは、4°Cで最大2週間保存でき、胚様体形成のための洗浄手順なしで直接使用できます。
    2. 細胞を播種する前に、アスピレーターまたはマルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから多元的溶液を取り出します。
    3. 開始する前に、1つの96ウェルプレート用に次の試薬を準備します:15 mL遠心チューブと5 mLの予熱済みDMEM:F12培地。11 mLの幹細胞培地に50 μM Y-27632を添加した多元処理プレート(上記の通り)。
    4. 60-70%コンフルエントiPS細胞の6ウェルプレートの1ウェルから培地を吸引します。PBSで細胞を一度洗浄します。トリプシンベースの試薬500 μLを添加し、37 °Cで2〜6分間インキュベートします。
      注:トリプシンベースの試薬で細胞を適切に剥離するためのインキュベーション時間は、細胞密度と各iPS細胞株の細胞マトリックス接着特性によって異なります。過剰消化を避けるために、トリプシンベースの試薬と2分間インキュベートした後、明視野顕微鏡を使用して細胞の形態を調べることをお勧めします。
    5. 1000 μLピペットを使用して細胞を分離し、DMEM:F12培地を使用して事前に調製した15 mL遠心チューブに移して解離を停止します。
    6. 細胞懸濁液を300 x gで3分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを保持します。50 μM Y-27632を添加した幹細胞培地1 mLに細胞を再懸濁します。
    7. セルカウンターを使用して細胞をカウントし、50 μM Y-27632を添加した幹細胞培地に希望数の細胞を加えます。単一の胚様体の生成には、細胞株にもよりますが、3,000〜12,000個の細胞が必要です。
    8. 10 mLピペットを使用して、細胞懸濁液をマルチチャンネル試薬リザーバーに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液の100 μL/ウェルを、以前にプルロン処理した96ウェルプレートにプレートします。
    9. 96ウェルプレートをインキュベーターに37°C、5%O2 および5%CO2で置きます。胚様体形成時の乱れを避けるため、プレートの移動はお控えください。
  2. 2日目:胚様体形成検査
    1. 胚様体形成を、明視野顕微鏡の10倍対物レンズを用いて調べます。胚様体は、明確なエッジと最小限の細胞死を示す必要があります。
    2. できるだけ多くの培地を吸引し、100 μL/ウェルの幹細胞培地と交換します。(クリティカル)胚様体は、培地交換中にウェルから簡単に取り出されます。それらを取り除かないように注意して、吸引後に培地を監視してください。
  3. 3日目:神経外胚葉導入
    1. できるだけ多くの培地を吸引し、120μL/ウェルの誘導培地と交換し、プレートを37°C、20%O2 、5%CO2に置きます。
  4. 6日目:埋め込み
    1. iPS細胞株にもよりますが、神経外胚葉の創発を誘発するのに3〜4日かかります。胚様体を定期的に監視します。エッジが明るくなると、胚様体を埋め込む準備が整います。以下に説明するように、胚様体の埋め込みに使用できる2つの異なる方法のいずれかを使用する24。
    2. 埋め込み方法1:Cookieの埋め込み
      1. 希釈されていない細胞外マトリックスゲルのアリコートを氷上で1〜2時間解凍します(重要)固まらないように、常に細胞外マトリックスゲルを氷上に保管してください。解凍時間と繰り返しの解凍サイクルを最小限に抑えるために、事前にアリコートを準備してください。
      2. クローニッパーを使用して200 μLピペットの先端を切断し、1.5 mLの微量遠心チューブ1本に16〜32個の胚様体を採取します。
      3. 培地67 μL中の胚様体を新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。カットした200 μLのピペットチップを使用して100 μLの細胞外マトリックスゲルを加え、穏やかに混合します。
      4. 胚様体を6cmの皿に均等に分散させ、プレートを5〜10分間置いて細胞外マトリックスゲルを固化させます。
      5. 約4 mLの分化培地を加え、37°C、20%O2 および5%CO2でインキュベートします。翌日、皿をオービタルシェーカー(84 rpm)に置きます。すべての胚様体が底部から分離していることを確認します。そうでない場合は、カットしたピペットチップとメディアを使用して、そっと取り外します。
    3. 埋め込み方法2:液体の埋め込み
      1. 希釈されていない細胞外マトリックスゲルのアリコートを氷上で1〜2時間解凍し、分化培地を氷上に置きます。(クリティカル)細胞外マトリックスゲルを添加する際、培地は氷のように冷たくなければなりません。
      2. 培地が冷えたら、細胞外マトリックスゲルを最終濃度の2%まで加えます。クローニッパーを使用して200 μLピペットの先端を切断し、最大24個の胚様体を6ウェルプレートの1ウェルに移します。
      3. 余分な培地をすべて取り除き、約4 mLの2%細胞外マトリックスゲル/分化培地を6ウェルプレートの1ウェルに加えます。すぐにプレートをオービタルシェーカー(84 rpm)に置きます。
  5. 9-20日目:3-4日ごとに分化メディアを使用して完全なメディア交換を行います。
  6. 21-30日目:オルガノイドを成熟培地に移し、3-4日ごとに完全な培地交換を行います。
  7. オルガノイドの解離:単一核および細胞の解離には、高品質のオルガノイドを使用してください。過剰な細胞死を避けるために、オルガノイドを定期的に切断して壊死性コアの蓄積を防ぎ、オルガノイドを2週間回復させてから、さらなる分析のためにオルガノイドを解離させます。

2. オルガノイドからのシングルセルの誘導

注:シングルセル解離は、機械的および酵素的解離を使用するNeural Tissue Dissociation Kit(表2)を使用して行われます。ここでは、手動の機械的解離について説明します。別の方法として、解離機を使用することができます。

  1. 氷上にSTOP溶液と0.04%BSAを調製します。酵素ミックス1と2、および0.04%BSAをPBSで調製し、氷上に置きます。
  2. 6ウェルプレートの1ウェルに最大5つのオルガノイドを採取し、余分な培地を吸引し、PBSで1回洗浄して培地を除去します。オルガノイドをウェルの中央に置き、メスを使用して、オルガノイドを徹底的にミンチします。
  3. 酵素ミックス1を加え、37°C、20%O2 、5%CO2で、90rpmで10〜15分間振とうします。
  4. 1000 μLのピペットチップを使用して、最大10回ピペッティングしてオルガノイドを再懸濁します。酵素ミックス2を加え、1000μLのピペットチップを使用してピペッティングしてよく混合します。37°C、20%O2 、5%CO2に置き、90rpmで10〜15分間振とうします。
  5. 細胞溶液を10mLの冷たいSTOP溶液に再懸濁することにより、解離プロセスを停止します。70 μMセルストレーナーを使用したセル溶液のろ過。ろ過した細胞溶液を300 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、ペレットを形成します。
  6. 培地を吸引し、細胞ペレットを残し、細胞を4 mLの冷たくした0.04% BSAに再懸濁します。40 μMセルストレーナーを使用して細胞溶液をろ過し、セルカウンターを使用して細胞をカウントします。
  7. 細胞溶液を300 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 BSA溶液を吸引し、細胞ペレットを残します。マイクロ流体ベースのsnRNA-seqキットマニュアルに従って、NSB+培地で細胞を再懸濁します。

3. オルガノイドからの単一核の単離

  1. オルガノイドを冷やしたPBSに移し、各オルガノイドを4つに切断します。オルガノイドを冷やしたPBSで2回洗浄します。
  2. 1000 μLピペットのピペット先端をハサミで切断し、オルガノイド片を2 mLのダウンサーに移します。PBSを完全に吸引し、NP40溶解バッファー1 mLを添加します。
  3. オンス乳棒Aで3倍、ドンス乳棒Bで3倍、懸濁液を15mLの遠心分離チューブに移します。ダウンサーを1 mLのNP40溶解バッファーで洗浄し、15 mLの遠心チューブに移します。室温で5分間インキュベートし、続いて懸濁液を500 x gで5分間遠心分離します 。
  4. 上清を吸引し、50μLの上清を残します。ペレットを乱さずにNSB+1 mLを加えます。インキュベーション5分後に再懸濁します。
  5. Percollグラジエントの上に層懸濁液を上に置く(下層:NSB +1 mLとPercoll 250 μL、中層:NSB+1 mLとPercoll 188 μL、最上層:NSB+1 mLとPercoll 125 μL)。(クリティカル)レイヤーの混合を避けるために、非常に慎重にレイヤー化を行ってください。
  6. 500 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引し、NSB+に再懸濁します。40 μMセルストレーナーを使用して核溶液をろ過します。
  7. DAPIとノイバウアーチャンバーを使用して核を染色し、カウントします。マイクロ流体工学に基づくscRNA-seqキットのマニュアルに従って核を再懸濁します。

4. ライブラリの調製とシーケンシング

  1. 10,000個の細胞と核をマイクロ流体システムにロードし、マイクロ流体ベースのscRNA-seqキットのマニュアルに従ってライブラリを生成します(Table of Materials)。
  2. snRNA-seqライブラリあたり推定6 x 108 リード、scRNA-seqライブラリあたり1.6 x 108 リードでライブラリをシーケンシングすると、snRNA-seqデータセットのシーケンシング飽和度は87%、scRNA-seqデータセットのシーケンシング飽和度は36%になります。

5. 分析

  1. scRNA-seqおよびsnRNA-seqのデータ解析パイプラインを用いてシーケンシングの解析を行い、ヒトGRCh38ゲノムに照らし合わせる。このパイプラインによって生成されたカウント行列を、RパッケージSeurat(バージョン4.1.1)25を使用してさらに分析します。
  2. 少なくとも 5 つの細胞で表される遺伝子を考慮し、少なくとも 300 個の遺伝子を含む細胞を組み込んで、Seurat オブジェクトを作成します。scRNA-seqデータセットでは1000個以上4000個未満の遺伝子を含む細胞を保持し、snRNA-seqデータセットでは核あたり800個以上4000個未満の遺伝子を含む細胞を保持することにより、追加の品質管理フィルタリングを実行します。データセット、細胞、および核のミトコンドリアリードが 5% を超えるものを除外します。
  3. 両方の方法間のバッチ効果を軽減するには、フィルタリングされた両方のデータセットを統合し、UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)を使用して正規化および視覚化します。低 Unique Molecular Identifier (UMI) と遺伝子数を示すクラスター 1 を省略します。その後、クラスターについて、既知のマーカー遺伝子とAna Uzquianoらの30日前のオルガノイドデータセットに基づいて細胞のアイデンティティを割り当てます。al. (Supplementary Coding File 1)18.

結果

scRNA-seqおよびsnRNA-seqを用いて脳オルガノイドの細胞型組成を調べるために、この段階では、中間前駆細胞と初期ニューロンに囲まれた前駆細胞からなる神経上皮ループをすでに示していたため、30日間の培養後に脳オルガノイドを回収した4,18。成長と培養全体を通じてオルガノイドの品質を監視することは、信頼性の高い単一細胞および単一核の?...

ディスカッション

単一細胞および単一核のトランスクリプトーム解析は、複雑な組織内の遺伝子調節メカニズムを理解するための極めて重要なツールとして浮上しています。どちらの方法も、脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究を可能にします。実験を全体的に成功させるためには、出発物質の品質が重要性が高いことが大切です。したがって、壊死性コアの形成を防ぐために、オルガノイドを定期?...

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

Miltenyi Neural Dissociationキットの元の指示を提供してくれたValeria Fernandez-Valloneに感謝します。また、NP40溶解バッファーのレシピと、このプロトコルの設定に関する貴重なアドバイスを提供してくださったMax Delbrueck CentrumのGenomics Technology Platformにも感謝します。また、研究室の組織的なサポートを提供してくださったMargareta Herzog氏とAlexandra Tschernycheff氏にも感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

参考文献

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