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要約

ここでは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングを使用したヒト脳オルガノイドの生成およびダウンストリーム解析のための包括的なプロトコールを紹介します。

要約

過去10年間で、シングルセルトランスクリプトミクスは大幅に進化し、個々の細胞の遺伝子発現プロファイルを同時に解析するための標準的な実験室法となり、細胞の多様性を捉えることが可能になりました。単離が困難な細胞タイプによる制限を克服するために、無傷の細胞ではなく単一の核を回収することを目的とした別のアプローチをシーケンシングに利用することができ、個々の細胞のトランスクリプトームプロファイリングを普遍的に適用できます。これらの技術は、脳オルガノイドの研究の基礎となり、発達中のヒト脳のモデルとして確立されています。脳オルガノイド研究におけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトミクスの可能性を活用するこのプロトコルは、オルガノイドの解離、シングルセルまたは核の単離、ライブラリ調製、シーケンシングなどの主要な手順を網羅したステップバイステップのガイドを提供します。これらの代替アプローチを実装することで、研究者は高品質のデータセットを取得でき、ニューロン細胞と非ニューロン細胞のタイプ、遺伝子発現プロファイル、および細胞系統の軌跡を同定できます。これにより、脳の発達を形作る細胞プロセスと分子メカニズムの包括的な研究が容易になります。

概要

ここ数年で、オルガノイド技術は臓器様組織を培養するための有望なツールとして浮上してきました1,2,3。特に、人間の脳など、簡単にアクセスできない臓器の場合、オルガノイドは発生や疾患の発現に関する洞察を得る機会を提供します4。このように、脳オルガノイドは、発達疾患、精神疾患、さらには神経変性疾患など、さまざまなヒトの脳障害を調査するための実験モデルとして広く使用されてきました4,5,6。

シングルセルトランスクリプトームプロファイリング技術の出現により、初代ヒト組織や複雑なin vitroモデルを前例のない粒度で研究できるようになり、健康や疾患における細胞亜集団レベルでの遺伝子発現変化に関するメカニズム的な洞察が得られ、新たな推定治療標的に関する情報を得ることができるようになった7,8,9

プロトコル

記載されているプロトコルは、マックス・デルブリュック分子医学センター(承認番号:138/08)のバイオセーフティレベル1の研究室で、研究における倫理に関するEUおよび国内の規則および要件に従って実施されます。

1. 人工多能性幹細胞(iPSC)からの前脳オルガノイドの作製

注:このプロトコルは、さまざまな企業のさまざまな幹細胞培地で培養したいくつかの異なるiPSC株について試験しました(表1)。前脳オルガノイドの作製は、高品質のiPS細胞に大きく依存し、プロトコール開始前に60%〜70%のコンフルエンスが必要です。ここでは、市販の細胞株を使用しました( 材料の表を参照)。

  1. 0日目:胚様体形成
    1. 96ウェルプレートをプルロン酸溶液で処理するには、96ウェルU底プレートのウェルあたり80 μLの滅菌ろ過済み2%プルロン酸溶液を添加します。室温(RT)または37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。
      注:プルロニック処理プレートは、4°Cで最大2週間保存でき、胚様体形成のための洗浄手順なしで直接使用できます。
    2. 細胞を播種する前に、アスピレーターまたはマルチチャンネルピペットを使用して各ウェルから多元的溶液を取り出します。
    3. 開始する前に、1....

代表的な結果

scRNA-seqおよびsnRNA-seqを用いて脳オルガノイドの細胞型組成を調べるために、この段階では、中間前駆細胞と初期ニューロンに囲まれた前駆細胞からなる神経上皮ループをすでに示していたため、30日間の培養後に脳オルガノイドを回収した4,18。成長と培養全体を通じてオルガノイドの品質を監視することは、信頼性の高い単一細胞および単一核の?.......

ディスカッション

単一細胞および単一核のトランスクリプトーム解析は、複雑な組織内の遺伝子調節メカニズムを理解するための極めて重要なツールとして浮上しています。どちらの方法も、脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究を可能にします。実験を全体的に成功させるためには、出発物質の品質が重要性が高いことが大切です。したがって、壊死性コアの形成を防ぐために、オルガノイドを定期?.......

開示事項

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

謝辞

Miltenyi Neural Dissociationキットの元の指示を提供してくれたValeria Fernandez-Valloneに感謝します。また、NP40溶解バッファーのレシピと、このプロトコルの設定に関する貴重なアドバイスを提供してくださったMax Delbrueck CentrumのGenomics Technology Platformにも感謝します。また、研究室の組織的なサポートを提供してくださったMargareta Herzog氏とAlexandra Tschernycheff氏にも感謝します。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

参考文献

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al.

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