قياس الاستعمار البكتيري على جذور أرابيدوبسيس ثاليانا في حالة الزراعة المائية

Summary

يعد استعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) في الغلاف الجذري أمرا ضروريا لتأثيره المعزز للنمو. من الضروري توحيد طريقة الكشف عن استعمار الجذور البكتيرية. هنا ، نصف طريقة قابلة للتكرار لقياس الاستعمار البكتيري على سطح الجذر.

Abstract

يعد قياس الاستعمار البكتيري على جذر Arabidopsis thaliana أحد أكثر التجارب شيوعا في دراسات التفاعل بين النبات والميكروب. طريقة موحدة لقياس الاستعمار البكتيري في الجذور ضرورية لتحسين التكاثر. قمنا أولا بزراعة A.thaliana المعقمة في ظروف الزراعة المائية ثم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدره_{OD 600} من 0.01. في 2 أيام بعد التلقيح ، تم حصاد أنسجة الجذر وغسلها ثلاث مرات في الماء المعقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. ثم تم وزن الجذور ، وتم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر بواسطة دوامة. تم تخفيف تعليق الخلية في تدرج مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا بالطلاء على وسط أجار Luria-Bertani (LB). تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، وبعد ذلك ، تم عد المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها للإشارة إلى الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن الاستعمار البكتيري في الجذور في ظروف التفاعل الأحادي ، مع قابلية استنساخ جيدة.

Introduction

هناك طرق كمية ونوعية للكشف عن استعمار الجذور بواسطة سلالة بكتيرية واحدة. بالنسبة للطريقة النوعية ، يجب استخدام سلالة تعبر بشكل أساسي عن التألق ، ويجب فحص توزيع التألق وشدته تحت المجهر الفلوري أو أدوات البؤر بالليزر ^1,2. يمكن أن تعكس هذه الاستراتيجيات الاستعمار البكتيري في الموقع³ ، لكنها ليست دقيقة مثل طرق عد الألواح التقليدية في القياس الكمي. إلى جانب ذلك ، نظرا لمحدودية عرض مناطق الجذر الجزئية فقط تحت المجهر ، يمكن أن تتأثر أحيانا بالتحيز الذاتي.

هنا ، نصف طريقة كمية ، والتي تتضمن جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة وعد وحدات CFU البكتيرية على طبق. تعتمد هذه الطريقة على التخفيف والطلاء الذي يمكن من خلاله حساب السلالات المستعمرة التي تم تجريدها من جذور النباتات ، ويمكن حساب إجمالي عدد البكتيريا المستعمرة على الجذر ^4,5.

أولا ، تم استزراع A. thaliana في ظروف الزراعة المائية ، ثم تم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدره 0.01 OD₆₀₀. تم حصاد الأنسجة الجذرية المصابة 2 أيام بعد التلقيح وغسلها في ماء معقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. علاوة على ذلك ، تم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر ، وتخفيفها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ومطلي على وسط أجار Luria-Bertani (LB). بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، تم حساب المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها لتحديد الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور.

هذه الطريقة قابلة للتطبيق بدرجة كبيرة ، ولديها قابلية تكرار جيدة ، وهي أكثر ملاءمة لتحديد الاستعمار البكتيري الجذري بدقة.

Protocol

1. الزراعة المائية المعقمة A. thaliana

1. تحضير شتلات A. thaliana .
   1. تحضير وسط شتلات A. thaliana المستزرع والذي يتكون من وسط 1/2 MS (Murashige و Skoog) مع 2٪ (وزن / حجم) سكروز و 0.9٪ (وزن / مجلد) أجار.
   2. صب وسط التعقيم المحضر في أطباق بتري مربعة معقمة (13 سم × 13 سم) قبل التصلب. تجنب تجفيف الهواء للحفاظ على الرطوبة.
   3. اغمر بذور A. thaliana في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مملوء ب 1 مل من الماء المعقم عند 4 درجات مئوية لأكثر من 12 ساعة ، ثم عقم البذور ب 1 مل من 2٪ (حجم / حجم) كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين.
   4. اغسل البذور جيدا بالماء المعقم ست مرات لإزالة محلول كلوريد الصوديوم. زرع البذور على أطباق بتري مع MS أجار المتوسطة مع طرف معقم 1 مل.
   5. ختم أطباق بتري مع شريط طبي تنفس ووضعها عموديا في حاضنة خفيفة لتنمو لمدة 1 أسبوع. اضبط نسبة حاضنة الضوء ليلا ونهارا على 16 ساعة / 8 ساعات ، وحافظ على درجة الحرارة عند 23 درجة مئوية والرطوبة عند 40٪ -60٪.
2. زرع A. ثاليانا.
   1. قطع ثقوب 5 مم على صبغة خلية بحجم 40 ميكرومتر وتعقيمها.
   2. زرع ثلاثة نباتات A. thaliana عمرها 7 أيام من خلال ثقوب مصفاة خلية ووضعها في صفيحة من 6 آبار تحتوي على 3 مل من السائل المعقم 1/2 MS وسط مع 0.5٪ سكروز.
   3. ضع الألواح المكونة من 6 آبار في حاضنة خفيفة (الشكل 1 أ) واحتضانها لمدة 10 أيام.

2. زراعة البكتيريا وتلقيحها

1. تحضير تعليق بكتيري للتلقيح.
   1. بالنسبة ل Bacillus velezensis ، قم بتلقيح الخلايا البكتيرية في وسط LB معقم واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 170 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى_{OD 600} من 0.8-1.2.
   2. جمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 6000 × غرام لمدة دقيقتين وإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت PBS (2 mM KH₂PO₄ ، 8 mM_{Na 2}HPO₄ ، 136 mM NaCl ، 2.6 mM KCl). كرر خطوات الطرد المركزي والتعليق 3 مرات لإزالة وسط LB والمستقلبات البكتيرية.
   3. تعليق خلايا البكتيريا في وسط جديد 1/2 مللي ثانية عند تركيز نهائي من OD₆₀₀ 0.01. تلقيح معلقات البكتيريا إلى لوحات 6 آبار التي تنمو شتلات A. thaliana ، ووضع لوحات 6 آبار في حاضنة الضوء ، وزراعتها لمدة 2 أيام.

3. قياس البكتيريا المستعمرة على الجذور

1. حصاد أنسجة الجذر ولوحة الخلايا المستعمرة.
   ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات في ظل ظروف جنوتوبيوتيك
   1. وزن أنابيب 2 مل وسجل الوزن ك W₀.
   2. حصاد الأنسجة الجذرية A. thaliana المشتركة وغسلها في الماء المعقم 3 مرات. ضع الجذر على ورق الترشيح لإزالة الماء الزائد.
   3. ضع الجذر في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الموزون ، وقم بوزن الجذور مع الأنبوب ، وقم بتسجيله ك W₁.
   4. أضف 1 مل من PBS إلى كل أنبوب ودوامة الأنابيب لمدة 8 دقائق بأقصى سرعة.
   5. تمييع المعلقات مع الخلايا البكتيرية المستعمرة الجذر التي تم جمعها إلى 1 × ^10-1-1 × ^10-4 (وفقا لقدرة استعمار البكتيريا). انشر المعلقات البكتيرية المخففة على ألواح تحتوي على وسط أجار LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.
2. عد المستعمرات وتطبيع البيانات.
   1. عد المستعمرات البكتيرية على ألواح LB.
   2. احسب وحدات CFU وفقا للتخفيف المقابل وقم بتطبيع البيانات بوزن جذر جديد (W_{1-W 0}). تشير النتائج النهائية إلى عدد الخلايا البكتيرية المستعمرة لكل جرام من الجذر في يومين بعد التلقيح (الشكل 1 ب).

النتائج

لاختبار دقة قدرة استعمار البكتيريا المكتشفة بهذه الطريقة في جذمور A. thaliana ، قمنا بتلقيح Bacillus velezensis SQR9 WT ومتحولة مشتقة Δ8mcp في A. thaliana rhizzosphere بشكل منفصل. Δ8mcp هو متحولة تفتقر إلى جميع جينات تشفير المستقبلات الكيميائية ، ولها استعمار منخفض بشكل ملحوظ⁶. قمنا ?...

Discussion

لتحقيق قابلية استنساخ جيدة ، هناك أربع خطوات حاسمة لعملية الكشف عن الاستعمار لهذا البروتوكول. أولا ، من الضروري التأكد من أن عدد خلايا البكتيريا الملقحة هو نفسه تماما في كل تجربة. ثانيا ، من الضروري أيضا التحكم في كثافة تنظيف البكتيريا غير المستعمرة بالماء المعقم. ثالثا ، يجب أن تكون كل عم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E