قياس الاستعمار البكتيري على جذور أرابيدوبسيس ثاليانا في حالة الزراعة المائية

Summary

يعد استعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) في الغلاف الجذري أمرا ضروريا لتأثيره المعزز للنمو. من الضروري توحيد طريقة الكشف عن استعمار الجذور البكتيرية. هنا ، نصف طريقة قابلة للتكرار لقياس الاستعمار البكتيري على سطح الجذر.

Abstract

يعد قياس الاستعمار البكتيري على جذر Arabidopsis thaliana أحد أكثر التجارب شيوعا في دراسات التفاعل بين النبات والميكروب. طريقة موحدة لقياس الاستعمار البكتيري في الجذور ضرورية لتحسين التكاثر. قمنا أولا بزراعة A.thaliana المعقمة في ظروف الزراعة المائية ثم تلقيح الخلايا البكتيرية في الجذور بتركيز نهائي قدره_{OD 600} من 0.01. في 2 أيام بعد التلقيح ، تم حصاد أنسجة الجذر وغسلها ثلاث مرات في الماء المعقم لإزالة الخلايا البكتيرية غير المستعمرة. ثم تم وزن الجذور ، وتم جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذر بواسطة دوامة. تم تخفيف تعليق الخلية في تدرج مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، متبوعا بالطلاء على وسط أجار Luria-Bertani (LB). تم تحضين الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات ، وبعد ذلك ، تم عد المستعمرات المفردة على ألواح LB وتطبيعها للإشارة إلى الخلايا البكتيرية المستعمرة على الجذور. تستخدم هذه الطريقة للكشف عن الاستعمار البكتيري في الجذور في ظروف التفاعل الأحادي ، مع قابلية استنساخ جيدة.

Introduction

هناك طرق كمية ونوعية للكشف عن استعمار الجذور بواسطة سلالة بكتيرية واحدة. بالنسبة للطريقة النوعية ، يجب استخدام سلالة تعبر بشكل أساسي عن التألق ، ويجب فحص توزيع التألق وشدته تحت المجهر الفلوري أو أدوات البؤر بالليزر ^1,2. يمكن أن تعكس هذه الاستراتيجيات الاستعمار البكتيري في الموقع³ ، لكنها ليست دقيقة مثل طرق عد الألواح التقليدية في القياس الكمي. إلى جانب ذلك ، نظرا لمحدودية عرض مناطق الجذر الجزئية فقط تحت المجهر ، يمكن أن تتأثر أحيانا بالتحيز الذاتي.

هنا ، نصف طريقة كمية ، والتي تتضمن جمع الخلايا البكتيرية المستعمرة وعد وحدات CFU البكتيرية على طبق. تعت....

Protocol

1. الزراعة المائية المعقمة A. thaliana

1. تحضير شتلات A. thaliana .
   1. تحضير وسط شتلات A. thaliana المستزرع والذي يتكون من وسط 1/2 MS (Murashige و Skoog) مع 2٪ (وزن / حجم) سكروز و 0.9٪ (وزن / مجلد) أجار.
   2. صب وسط التعقيم المحضر في أطباق بتري مربعة معقمة (13 سم × 13 سم) قبل التصلب. تجنب تجفيف الهواء للحفاظ على الرطوبة.
   3. اغمر بذور A. thaliana في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل مملوء ب 1 مل من الماء المعقم عند 4 درجات مئوية لأكثر من 12 ساعة ، ثم عقم البذور ب 1 مل من 2٪ (حجم / حجم) كلوريد الصوديوم لمدة دقيقتين.
   4. اغسل البذور جيدا بالماء المعقم ست مرات لإزالة محلول كل....

النتائج

لاختبار دقة قدرة استعمار البكتيريا المكتشفة بهذه الطريقة في جذمور A. thaliana ، قمنا بتلقيح Bacillus velezensis SQR9 WT ومتحولة مشتقة Δ8mcp في A. thaliana rhizzosphere بشكل منفصل. Δ8mcp هو متحولة تفتقر إلى جميع جينات تشفير المستقبلات الكيميائية ، ولها استعمار منخفض بشكل ملحوظ⁶. قمنا ?.......

Discussion

لتحقيق قابلية استنساخ جيدة ، هناك أربع خطوات حاسمة لعملية الكشف عن الاستعمار لهذا البروتوكول. أولا ، من الضروري التأكد من أن عدد خلايا البكتيريا الملقحة هو نفسه تماما في كل تجربة. ثانيا ، من الضروري أيضا التحكم في كثافة تنظيف البكتيريا غير المستعمرة بالماء المعقم. ثالثا ، يجب أن تكون كل عم?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E