Medición de la colonización bacteriana en raíces de Arabidopsis thaliana en condiciones hidropónicas

Resumen

La colonización de las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) en la rizosfera es esencial para su efecto promotor del crecimiento. Es necesario estandarizar el método de detección de la colonización bacteriana de la rizosfera. Aquí, describimos un método reproducible para cuantificar la colonización bacteriana en la superficie de la raíz.

Resumen

La medición de la colonización bacteriana en la raíz de Arabidopsis thaliana es uno de los experimentos más frecuentes en los estudios de interacción planta-microbio. Es necesario un método estandarizado para medir la colonización bacteriana en la rizosfera para mejorar la reproducibilidad. Primero cultivamos A. thaliana estéril en condiciones hidropónicas y luego inoculamos las células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de OD₆₀₀ de 0,01. A los 2 días después de la inoculación, el tejido de la raíz se cosechó y se lavó tres veces en agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. A continuación, se pesaron las raíces y se recogieron por vórtice las células bacterianas colonizadas en la raíz. La suspensión celular se diluyó en un gradiente con un tampón salino tamponado con fosfato (PBS), seguido de un recubrimiento en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Las placas se incubaron a 37 °C durante 10 h y, a continuación, se contaron y normalizaron las colonias individuales en placas LB para indicar las células bacterianas colonizadas en las raíces. Este método se utiliza para detectar la colonización bacteriana en la rizosfera en condiciones de mono-interacción, con buena reproducibilidad.

Introducción

Existen métodos cuantitativos y cualitativos para detectar la colonización de la rizosfera por una sola cepa bacteriana. Para el método cualitativo, se debe utilizar una cepa que exprese fluorescencia constitutivamente, y la distribución e intensidad de la fluorescencia debe examinarse con microscopía de fluorescencia o instrumentos confocales láser ^1,2. Esas estrategias pueden reflejar bien la colonización bacteriana in situ³, pero no son tan precisas como los métodos tradicionales de recuento en placa en la cuantificación. Además, debido a la limitación de mostrar solo zonas ....

Protocolo

1. Cultivo hidropónico estéril de A. thaliana

1. Prepara las plántulas de A. thaliana .
   1. Prepare el medio de cultivo de plántulas de A. thaliana , que consiste en 1/2 medio MS (Murashige y Skoog) con 2% (peso/volumen) de sacarosa y 0,9% (peso/volumen) de agar.
   2. Vierta el medio de esterilización preparado en placas de Petri cuadradas estériles (13 cm x 13 cm) antes de la solidificación. Evite secar al aire para mantener la humedad.
   3. Sumerja las semillas de A. thaliana en un tubo de microcentrífuga de 2 mL lleno con 1 mL de agua estéril a 4 °C durante más de 12 h, y lu....

Discusión

Para lograr una buena reproducibilidad, hay cuatro pasos críticos para el proceso de detección de colonización de este protocolo. En primer lugar, es necesario asegurarse de que el número de células bacterianas inoculadas sea exactamente el mismo en cada experimento. En segundo lugar, también es necesario controlar la intensidad de limpieza de las bacterias no colonizadas con agua estéril. En tercer lugar, cada proceso de dilución de la muestra debe ser vertiginado antes de realizarse para que la muestra esté en.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E