Medición de la colonización bacteriana en raíces de Arabidopsis thaliana en condiciones hidropónicas

Resumen

La colonización de las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) en la rizosfera es esencial para su efecto promotor del crecimiento. Es necesario estandarizar el método de detección de la colonización bacteriana de la rizosfera. Aquí, describimos un método reproducible para cuantificar la colonización bacteriana en la superficie de la raíz.

Resumen

La medición de la colonización bacteriana en la raíz de Arabidopsis thaliana es uno de los experimentos más frecuentes en los estudios de interacción planta-microbio. Es necesario un método estandarizado para medir la colonización bacteriana en la rizosfera para mejorar la reproducibilidad. Primero cultivamos A. thaliana estéril en condiciones hidropónicas y luego inoculamos las células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de OD₆₀₀ de 0,01. A los 2 días después de la inoculación, el tejido de la raíz se cosechó y se lavó tres veces en agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. A continuación, se pesaron las raíces y se recogieron por vórtice las células bacterianas colonizadas en la raíz. La suspensión celular se diluyó en un gradiente con un tampón salino tamponado con fosfato (PBS), seguido de un recubrimiento en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Las placas se incubaron a 37 °C durante 10 h y, a continuación, se contaron y normalizaron las colonias individuales en placas LB para indicar las células bacterianas colonizadas en las raíces. Este método se utiliza para detectar la colonización bacteriana en la rizosfera en condiciones de mono-interacción, con buena reproducibilidad.

Introducción

Existen métodos cuantitativos y cualitativos para detectar la colonización de la rizosfera por una sola cepa bacteriana. Para el método cualitativo, se debe utilizar una cepa que exprese fluorescencia constitutivamente, y la distribución e intensidad de la fluorescencia debe examinarse con microscopía de fluorescencia o instrumentos confocales láser ^1,2. Esas estrategias pueden reflejar bien la colonización bacteriana in situ³, pero no son tan precisas como los métodos tradicionales de recuento en placa en la cuantificación. Además, debido a la limitación de mostrar solo zonas radiculares parciales bajo el microscopio, a veces puede estar influenciado por un sesgo subjetivo.

Aquí, describimos un método cuantitativo, que incluye la recolección de las células bacterianas colonizadas y el recuento de las UFC bacterianas en una placa. Este método se basa en la dilución y el recubrimiento mediante el cual se pueden contar las cepas colonizadas que se eliminaron de las raíces de las plantas, y se puede calcular el número total de bacterias colonizadas en la raíz ^4,5.

Primero, A. thaliana se cultivó en condiciones hidropónicas, y luego se inocularon células bacterianas en la rizosfera a una concentración final de 0.01 OD₆₀₀. Los tejidos radiculares infectados se recolectaron 2 días después de la inoculación y se lavaron con agua estéril para eliminar las células bacterianas no colonizadas. Además, se recolectaron células bacterianas colonizadas en la raíz, se diluyeron en tampón salino tamponado con fosfato (PBS) y se colocaron en un medio de agar Luria-Bertani (LB). Después de la incubación a 37 °C durante 10 h, se contaron y normalizaron colonias individuales en placas LB para determinar las células bacterianas colonizadas en las raíces.

Este método es altamente aplicable, tiene buena repetibilidad y es más adecuado para la determinación precisa de la colonización bacteriana de la rizosfera.

Protocolo

1. Cultivo hidropónico estéril de A. thaliana

1. Prepara las plántulas de A. thaliana .
   1. Prepare el medio de cultivo de plántulas de A. thaliana , que consiste en 1/2 medio MS (Murashige y Skoog) con 2% (peso/volumen) de sacarosa y 0,9% (peso/volumen) de agar.
   2. Vierta el medio de esterilización preparado en placas de Petri cuadradas estériles (13 cm x 13 cm) antes de la solidificación. Evite secar al aire para mantener la humedad.
   3. Sumerja las semillas de A. thaliana en un tubo de microcentrífuga de 2 mL lleno con 1 mL de agua estéril a 4 °C durante más de 12 h, y luego esterilice las semillas con 1 mL de NaClO al 2% (vol/vol) durante 2 min.
   4. Lave bien las semillas con agua estéril seis veces para eliminar la solución de NaClO. Siembre las semillas en placas de Petri con medio de agar MS con una punta estéril de 1 mL.
   5. Selle las placas de Petri con cinta médica transpirable y colóquelas verticalmente en una incubadora ligera para que crezcan durante 1 semana. Ajuste la relación día/noche de la incubadora de luz a 16 h/8 h, mantenga la temperatura a 23 °C y la humedad entre el 40% y el 60%.
2. Trasplante de A. thaliana.
   1. Corte agujeros de 5 mm en un tintor celular de 40 μm de tamaño de poro y estériles.
   2. Trasplante tres plantas de A. thaliana de 7 días de edad a través de los orificios de un colador de células y colóquelas en una placa de 6 pocillos que contenga 3 mL de medio líquido estéril 1/2 MS con 0.5% de sacarosa.
   3. Coloque las placas de 6 pocillos en una incubadora ligera (Figura 1A) e incube durante 10 días.

2. Cultivo e inoculación de bacterias

1. Prepare la suspensión bacteriana para la inoculación.
   1. En el caso de Bacillus velezensis, inocular las células bacterianas en un medio LB estéril e incubar a 37 °C agitando a 170 rpm hasta alcanzar un diámetro exterior de₆₀₀ de 0,8-1,2.
   2. Recoja las células bacterianas por centrifugación a 6000 x g durante 2 min y vuelva a suspender las células en tampón PBS (2 mM KH₂PO₄, 8 mM Na₂HPO₄, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl). Repita los pasos de centrifugado y resuspensión 3 veces para eliminar el medio LB y los metabolitos bacterianos.
   3. Suspender las células bacterianas en un medio fresco de 1/2 MS a una concentración final de OD₆₀₀ 0,01. Inocular las suspensiones de bacterias en las placas de 6 pocillos que cultivan plántulas de A. thaliana , colocar las placas de 6 pocillos en la incubadora de luz y cultivarlas durante 2 días.

3. Medición de bacterias colonizadas en las raíces

1. Recolecta el tejido de la raíz y coloca las células colonizadas.
   NOTA: Todos los pasos deben realizarse bajo condiciones gnotobióticas
   1. Pesa los tubos de 2 ml y registra el peso como W₀.
   2. Coseche los tejidos de la raíz de A. thaliana cocultivados y lávelos en agua estéril 3 veces. Coloca la raíz sobre papel de filtro para eliminar el exceso de agua.
   3. Coloque la raíz en el tubo de microcentrífuga pesado, pese las raíces junto con el tubo y regístrelo como W₁.
   4. Agregue 1 mL de PBS a cada tubo y haga vórtice los tubos durante 8 min a la velocidad máxima.
   5. Diluir las suspensiones con las células bacterianas colonizadas por las raíces recolectadas a 1 x ^10-1-1 x ^10-4 (de acuerdo con la capacidad de colonización de las bacterias). Extienda las suspensiones bacterianas diluidas en placas que contengan medio de agar LB e incube a 37 °C durante 10 h.
2. Cuente las colonias y normalice los datos.
   1. Cuente las colonias bacterianas en placas LB.
   2. Calcular las UFCs según la dilución correspondiente y normalizar los datos con el peso fresco de la raíz (W_{1-W 0}). Los resultados finales indican el recuento de células bacterianas colonizadas por gramo de raíz a los 2 días después de la inoculación (Figura 1B).

Resultados

Para probar la precisión de la capacidad de colonización de bacterias detectada por este método en la rizosfera de A. thaliana, inoculamos Bacillus velezensis SQR9 WT y un mutante derivado Δ8mcp en la rizosfera de A. thaliana por separado. El Δ8mcp es un mutante que carece de todos los genes que codifican para quimiorreceptores, y tiene una colonización significativamente disminuida⁶. Se midió su colonización a los 2 días después de la inocula...

Discusión

Para lograr una buena reproducibilidad, hay cuatro pasos críticos para el proceso de detección de colonización de este protocolo. En primer lugar, es necesario asegurarse de que el número de células bacterianas inoculadas sea exactamente el mismo en cada experimento. En segundo lugar, también es necesario controlar la intensidad de limpieza de las bacterias no colonizadas con agua estéril. En tercer lugar, cada proceso de dilución de la muestra debe ser vertiginado antes de realizarse para que la muestra esté en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E