Hidroponik Durumdaki Arabidopsis thaliana Köklerinde Bakteri Kolonizasyonunun Ölçülmesi

Özet

Rizosferde bitki büyümesini teşvik eden rizobakterilerin (PGPR) kolonizasyonu, büyümeyi teşvik edici etkisi için gereklidir. Bakteriyel rizosfer kolonizasyonunun tespit yöntemini standartlaştırmak gerekir. Burada, kök yüzeyindeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Arabidopsis thaliana kökü üzerinde bakteri kolonizasyonunun ölçülmesi, bitki-mikrop etkileşimi çalışmalarında en sık yapılan deneylerden biridir. Tekrarlanabilirliği artırmak için rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu ölçmek için standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. Önce steril A.thaliana'yı hidroponik koşullarda kültürledik ve daha sonra rizosferdeki bakteri hücrelerini 0.01'lik bir OD₆₀₀ nihai konsantrasyonunda aşıladık. Aşılamadan 2 gün sonra, kök dokusu toplandı ve kolonize olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak için steril suda üç kez yıkandı. Kökler daha sonra tartıldı ve kök üzerinde kolonize olan bakteri hücreleri girdap ile toplandı. Hücre süspansiyonu, bir fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ile bir gradyan içinde seyreltildi, ardından bir Luria-Bertani (LB) agar ortamı üzerine kaplandı. Plakalar 37 ° C'de 10 saat inkübe edildi ve daha sonra, LB plakaları üzerindeki tek koloniler sayıldı ve kökler üzerinde kolonize olan bakteri hücrelerini belirtmek için normalize edildi. Bu yöntem, iyi tekrarlanabilirlik ile mono etkileşim koşullarında rizosferdeki bakteri kolonizasyonunu tespit etmek için kullanılır.

Giriş

Tek bir bakteri suşu ile rizosfer kolonizasyonunu tespit etmek için kantitatif ve kalitatif yöntemler vardır. Kalitatif yöntem için, floresansı yapısal olarak ifade eden bir suş kullanılmalı ve floresan dağılımı ve yoğunluğu floresan mikroskobu veya lazer konfokal aletler ^1,2 altında incelenmelidir. Bu stratejiler, in situ 3'te bakteri kolonizasyonunu iyi bir şekilde yansıtabilir, ancak miktar belirlemede geleneksel plaka sayma yöntemleri kadar doğru değildir. Ayrıca, mikroskop altında sadece kısmi kök bölgelerinin gösterilmesinin sınırlılığı nedeniyle, bazen subjektif önyargıd....

Protokol

1. Steril hidroponik A. thaliana yetiştiriciliği

1. A. thaliana fidelerini hazırlayın.
   1. % 2 (ağırlıkça / hacim) sükroz ve% 0.9 (ağırlıkça / hacim) agar ile 1/2 MS ortamdan (Murashige ve Skoog) oluşan kültür A. thaliana fidanları ortamını hazırlayın.
   2. Hazırlanan sterilizasyon ortamını katılaşmadan önce steril kare Petri kaplarına (13 cm x 13 cm) dökün. Nemi korumak için havayla kurutmaktan kaçının.
   3. A. thaliana tohumlarını 1 mL steril su ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüpüne 4 ° C'de 12 saatten fazla daldırın ve ardından tohumları 1 mL% 2 (hacim / hacim) NaClO i....

Tartışmalar

İyi bir tekrarlanabilirlik elde etmek için, bu protokolün kolonizasyon tespit süreci için dört kritik adım vardır. İlk olarak, aşılanan bakteri hücrelerinin sayısının her deneyde tam olarak aynı olduğundan emin olmak gerekir. İkincisi, kolonize olmayan bakteri temizleme yoğunluğunu steril su ile kontrol etmek de gereklidir. Üçüncüsü, mikrosantrifüj tüpüne batması kolay olan bakterilerin özelliklerinden dolayı absorpsiyon hatalarını önlemek için numunenin tam bir karıştırma durumunda .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E