Misurazione della colonizzazione batterica sulle radici di Arabidopsis thaliana in condizioni idroponiche

Riepilogo

La colonizzazione dei rizobatteri che promuovono la crescita delle piante (PGPR) nella rizosfera è essenziale per il suo effetto di promozione della crescita. È necessario standardizzare il metodo di rilevamento della colonizzazione batterica della rizosfera. Qui descriviamo un metodo riproducibile per quantificare la colonizzazione batterica sulla superficie della radice.

Abstract

La misurazione della colonizzazione batterica sulla radice di Arabidopsis thaliana è uno degli esperimenti più frequenti negli studi di interazione pianta-microbi. Un metodo standardizzato per misurare la colonizzazione batterica nella rizosfera è necessario per migliorare la riproducibilità. Abbiamo prima coltivato A.thaliana sterile in condizioni idroponiche e poi abbiamo inoculato le cellule batteriche nella rizosfera a una concentrazione finale di OD₆₀₀ di 0,01. A 2 giorni dall'inoculazione, il tessuto radicale è stato raccolto e lavato tre volte in acqua sterile per rimuovere le cellule batteriche non colonizzate. Le radici sono state quindi pesate e le cellule batteriche colonizzate sulla radice sono state raccolte a vortice. La sospensione cellulare è stata diluita in un gradiente con un tampone salino tamponato con fosfato (PBS), seguito da una placcatura su un terreno di agar Luria-Bertani (LB). Le piastre sono state incubate a 37 °C per 10 ore, quindi le singole colonie su piastre LB sono state contate e normalizzate per indicare le cellule batteriche colonizzate sulle radici. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la colonizzazione batterica nella rizosfera in condizioni di mono-interazione, con una buona riproducibilità.

Introduzione

Esistono metodi quantitativi e qualitativi per rilevare la colonizzazione della rizosfera da parte di un singolo ceppo batterico. Per il metodo qualitativo, dovrebbe essere utilizzato un ceppo che esprime costitutivamente la fluorescenza e la distribuzione e l'intensità della fluorescenza dovrebbero essere esaminate al microscopio a fluorescenza o con strumenti confocali laser ^1,2. Queste strategie possono riflettere bene la colonizzazione batterica in situ³, ma non sono accurate come i metodi tradizionali di conteggio su piastra nella quantificazione. Inoltre, a causa della li....

Protocollo

1. Coltivazione idroponica sterile di A. thaliana

1. Prepara le piantine di A. thaliana .
   1. Preparare il terreno di coltura delle piantine di A. thaliana , che consiste in 1/2 terreno MS (Murashige e Skoog) con il 2% (wt/vol) di saccarosio e lo 0,9% (wt/vol) di agar.
   2. Versare il terreno di sterilizzazione preparato in piastre di Petri quadrate sterili (13 cm x 13 cm) prima della solidificazione. Evitare l'asciugatura all'aria per mantenere l'umidità.
   3. Immergere i semi di A. thaliana in una provetta da microcentrifuga da 2 ml riempita con 1 ml di acqua sterile a 4 °C p....

Discussione

Per ottenere una buona riproducibilità, ci sono quattro passaggi critici per il processo di rilevamento della colonizzazione di questo protocollo. In primo luogo, è necessario assicurarsi che il numero di cellule batteriche inoculate sia esattamente lo stesso in ogni esperimento. In secondo luogo, è necessario anche controllare l'intensità di pulizia dei batteri non colonizzati con acqua sterile. In terzo luogo, ogni processo di diluizione del campione deve essere agitato prima di essere eseguito per lasciare che il .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E