Измерение бактериальной колонизации корнями Arabidopsis thaliana в гидропонном состоянии

Резюме

Колонизация ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR) в ризосфере, имеет важное значение для ее стимулирующего рост эффекта. Необходимо стандартизировать метод выявления бактериальной ризосферной колонизации. Здесь мы описываем воспроизводимый метод количественной оценки бактериальной колонизации на поверхности корня.

Аннотация

Измерение бактериальной колонизации корня Arabidopsis thaliana является одним из наиболее частых экспериментов в исследованиях взаимодействия растений и микробов. Стандартизированный метод измерения бактериальной колонизации в ризосфере необходим для улучшения воспроизводимости. Сначала мы культивировали стерильную A.thaliana в гидропонных условиях, а затем инокулировали бактериальные клетки в ризосфере при конечной концентрации OD₆₀₀ 0,01. Через 2 дня после инокуляции ткань корня собирали и трижды промывали в стерильной воде для удаления неколонизированных бактериальных клеток. Затем корни взвешивали, и бактериальные клетки, колонизированные на корню, собирали вихрем. Клеточную суспензию разбавляли градиентом с фосфатно-солевым буфером (PBS) с последующим нанесением на агаровую среду Лурии-Бертани (LB). Планшеты инкубировали при 37 °C в течение 10 часов, а затем подсчитывали и нормализовали единичные колонии на LB-планшетах, чтобы указать на бактериальные клетки, колонизированные на корнях. Этот метод используется для обнаружения бактериальной колонизации в ризосфере в условиях моновзаимодействия, с хорошей воспроизводимостью.

Введение

Существуют количественные и качественные методы выявления колонизации ризосферы одним штаммом бактерий. Для качественного метода следует использовать штамм, который конститутивно экспрессирует флуоресценцию, а распределение и интенсивность флуоресценции следует исследовать с помощью флуоресцентной микроскопии или лазерных конфокальных инструментов ^1,2. Эти стратегии могут хорошо отражать бактериальную колонизацию in situ³, но они не так точны, как традиционные методы подсчета планшетов при количественной оценке. Кроме того, из-за ограничения отображения под микроскопом только ч....

протокол

1. Стерильное гидропонное выращивание A. thaliana

1. Подготовьте рассаду A. thaliana .
   1. Приготовьте проросток культуры A. thaliana в среде, которая состоит из 1/2 среды МС (Мурасиге и Скуг) с 2% (масс./об.) сахарозы и 0,9% (масс./об.) агара.
   2. Подготовленную стерилизационную среду вылить в стерильные квадратные чашки Петри (13 см х 13 см) до застывания. Избегайте сушки воздуха для поддержания влажности.
   3. Погрузите семена A. thaliana в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, заполненную 1 мл стерильной воды при температуре 4 °C, на более чем 12 ч, а затем стерилизуйте....

Результаты

Чтобы проверить точность способности бактерий к колонизации, обнаруженной этим методом в ризосфере A. thaliana, мы инокулировали Bacillus velezensis SQR9 WT и полученный мутантный Δ8mcp в ризосферу A. thaliana отдельно. Δ8mcp является мутантом, в котором отсутствуют все гены, кодирующие .......

Обсуждение

Для достижения хорошей воспроизводимости существует четыре критических шага для процесса обнаружения колонизации этого протокола. Во-первых, необходимо убедиться, что количество инокулированных клеток бактерий в каждом эксперименте одинаково. Во-вторых, также необходим контроль ин?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Corning	3516
Filter cell stainer	Solarbio	F8200-40µm
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO
Murashige and Skoog medium	Hopebio	HB8469-5
NaClO	Alfa	L14709
Phytagel	Sigma-Aldrich	P8169
Square petri dish	Ruiai Zhengte	PYM-130
Vortex Genie2	Scientific Industries	G560E