إنشاء نموذج فئران إصابة العصب الوجهي لأبحاث شلل الوجه مجهول السبب

Summary

يضع البروتوكول الحالي نموذجا لإصابة العصب الوجهي باستخدام الفحص المجهري للتحقيق في الآليات التشخيصية والعلاجية لشلل الوجه مجهول السبب.

Abstract

شلل الوجه مجهول السبب هو أكثر أنواع إصابات العصب الوجهي شيوعا ، حيث يمثل ما يقرب من 70٪ من حالات شلل الوجه المحيطي. لا يمكن أن يؤدي هذا المرض إلى تغيير في تعبيرات الوجه فحسب ، بل يؤثر أيضا بشكل كبير على نفسية المرضى. في الحالات الشديدة ، يمكن أن يؤثر على العمل الطبيعي وحياة المرضى. لذلك ، فإن البحث عن إصلاح إصابات العصب الوجهي له أهمية سريرية مهمة. من أجل دراسة آلية هذا المرض ، من الضروري إجراء تجارب حيوانية ذات صلة ، من بينها أهم مهمة إنشاء نموذج حيواني له نفس التسبب في المرض البشري. إن ضغط العصب الوجهي داخل العظم الصخري ، وخاصة جذع العصب عند تقاطع الطرف البعيد للقناة السمعية الداخلية وجزء المتاهة ، هو التسبب في شلل الوجه مجهول السبب. من أجل محاكاة هذا المرض الشائع ، تم إنشاء نموذج إصابة الضغط للجزء الرئيسي خارج الجمجمة من العصب الوجهي في هذه الدراسة. تم تقييم الضرر العصبي عن طريق الفحص السلوكي والفيزيولوجي الكهربي والنسيجي. أخيرا ، تم اختيار 50 جم من القوة الثابتة و 90 ثانية إصابة المشبك كمعلمات إصابة لبناء نموذج مستقر لشلل الوجه مجهول السبب.

Introduction

كنوع من شلل الوجه المحيطي ، فإن شلل الوجه مجهول السبب هو سمة من سمات المسببات غير المعروفة ، والبداية الحادة ، والدورة المحددة ذاتيا^1،2. لا تزال مسببات وشلل الوجه مجهول السبب غير مؤكدة³. في الوقت الحاضر ، هناك طرق علاج مختلفة لشلل الوجه⁴ ، ويعكس تنوع العلاجات عدم وجود خيارات العلاج المثلى. يعد استخدام تقنيات البيولوجيا الخلوية والجزيئية لدراسة آلية إصابة العصب الوجهي هو الأساس لإنشاء طرق علاج فعالة لشلل الوجه. لذلك ، فإن نموذج إصابة العصب الوجهي المناسب والمستقر مهم بشكل خاص.

في الوقت الحاضر ، لا توجد طريقة قياسية لإنشاء نموذج إصابة العصب الوجهي. تشمل طرق التحضير الحالية تطعيم الفيروس⁵ ، والتقسيم⁶ ، والتحفيز البارد⁷ ، والضغط⁸ . يعتقد أن العدوى الفيروسية ، والتشنج الوعائي الغاذي العصبي ، والتهاب المناعة الذاتية ، وما إلى ذلك ، قد تسبب نقص التروية الموضعي والتنكس والوذمة في العصب الوجهي^9،10،11. علاوة على ذلك ، يمكن أن تسبب جميع العوامل المذكورة أعلاه ضغطا على الجذع الرئيسي للعصب الوجهي في قناة العصب الوجهي العظمية الضيقة^12،13. بالإضافة إلى ذلك ، كانت إصابات الأعصاب الطرفية الأكثر شيوعا التي تم تحديدها أثناء العمليات الجراحية هي الضغط والكدمة¹⁴. بناء على النظريات والظواهر السريرية المذكورة أعلاه ، نعتقد أن إعداد نموذج إصابة العصب الوجهي من خلال إصابة الضغط أكثر منطقية. ومع ذلك ، فإن معظم الطرق الحالية لتنفيذ إصابات الضغط لا توفر معايير كمية للقوة والوقت. في هذه الدراسة ، قمنا بقياس قوة ومدة إصابة الضغط لتحسين قابلية استنساخ النموذج المعمول به.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على والإشراف عليها من قبل لجنة أخلاقيات في مستشفى شينخوا التابعة لكلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ (XHEC-F-2023-061). تم استخدام ذكور الفئران Sprague-Dawley ، 200-300 جم ، في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات (ن = 10): مجموعة جراحة الشام ، ومجموعة الإصابة 30 ثانية ، ومجموعة إصابة 60 ثانية ، ومجموعة إصابة 90 ثانية.

1. تحريض التخدير وإعداد

1. ارتد معدات الحماية الشخصية التالية: قناع جراحي ، قفازات جراحية ، ثوب يمكن التخلص منه.
2. قم بوزن الفئران وتخديرها بهيدروكلوريد الكيتامين بجرعة 50 مجم / كجم عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP). تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ؛ IP) للمسكنات المحيطة بالجراحة. تأكد من عمق التخدير باستخدام قرصة إصبع القدم.
3. ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف.
4. بعد التخدير ، ضع الفئران في وضع الانبطاح وقم بتثبيت الرأس بحيث يكون الجانب الأيسر من الوجه لأعلى. احلق الشعر خلف الأذن اليسرى وقم بتطهير الجلد. قم بتغطية الجرذ بالستارة الجراحية المعقمة.

2. إنشاء نموذج إصابة سحق موضعي للجذع خارج الجمجمة للعصب الوجهي

ملاحظة: تعقيم جميع المعدات قبل الاستخدام. تم إجراء جميع العمليات في غرفة العمليات.

1. قم بعمل شق طولي بطول 2 سم خلف الأذن اليسرى ، وقم بتشريح الجلد والأنسجة تحت الجلد لفصل الفجوة الطبيعية بين عضلات الوجه وعنق الرحم.
2. استخدم ملاقط دقيقة ومقصات دقيقة لفصل جذع العصب الوجهي تماما بين الثقبة القارية والغدة النكفية ، بطول مكشوف يبلغ حوالي 1 سم.
3. استخدم ملقط الإصابات الكمية للأعصاب الطرفية (جدول المواد) لتثبيت جذع العصب الوجهي لإحداث إصابة. حدد موقع الإصابة على بعد 0.5 سم من الثقبة العليا العلوي. ضع شدة إصابة قدرها 50 جم ووقت إصابة 30 ثانية و 60 ثانية و 90 ثانية على التوالي.
4. خياطة تحت الجلد والجلد بخيط الحرير. تطهير الشق.
5. بالنسبة للفئران في مجموعة التحكم في الجراحة الصورية ، قم بقطع الجلد والأنسجة تحت الجلد بعد التخدير وكشف وفصل الجذع الرئيسي المقابل للعصب الوجهي. بعد ذلك ، خياطة الشق على الفور.
6. راقب صحة ، وحافظ على الاستلقاء القصي ، واحتفظ به في ظروف دافئة.
7. انقل الجرذ مرة أخرى إلى قفص السكن بعد أن يكون الجرذ واعيا.

3. الاختبار السلوكي

ملاحظة: تم تقييم وظيفة العصب الوجهي للفئران قبل الجراحة وبعد 48 ساعة من الجراحة (الشكل 1). تم حساب درجات رد الفعل الوميض وحركة الججس وموضع طرف الأنف¹⁵. كلما ارتفعت الدرجة الإجمالية ، زادت شدة درجة إصابة العصب الوجهي (الجدول 1).

1. منعكس الوميض (BR):
   1. قم بتوصيل إبرة 18 جم بحقنة سعة 2 مل ونفخ الهواء في عين الفئران من مسافة 2 سم. راقب حركة الجفن وإغلاقه.
   2. النتيجة وفقا للمعايير التالية: لا يوجد فرق كبير على كلا الجانبين: 0 نقطة. تأخر إغلاق الجانب المصاب مقارنة بالجانب السليم: 1 نقطة ؛ عدم القدرة على إغلاق الجفن المصاب: 2 نقطة.
2. حركة الاهتزازات (VM):
   1. احسب حركات المجسات الثنائية للفئران في غضون 30 ثانية.
   2. النتيجة وفقا للمعايير التالية: لا يوجد فرق كبير في حركة المجسات الثنائية: 0 نقطة ؛ حركة شعيرات الجانب المصاب أضعف من حركة الجانب السليم: 1 نقطة ؛ فقدان حركة الشعيرات على الجانب المصاب: 2 نقطة.
3. وضع طرف الأنف.
   1. طرف الأنف المركزي: 0 نقطة ؛ طرف الأنف يميل نحو الجانب الصحي: 1 نقطة.
      ملاحظة: تشير النتيجة الإجمالية البالغة 0 نقطة إلى الوضع الطبيعي ، وتشير 1-2 نقطة إلى شلل خفيف في الوجه (شلل جزئي) ، وتشير 3-4 نقاط إلى شلل واضح في الوجه (شلل جزئي) ، و 5 نقاط تشير إلى شلل كامل في الوجه¹⁵.

4. الكشف الفيزيولوجي الكهربي العصبي

ملاحظة: تم إجراء التصوير الكهربائي للوجه (ENoG) قبل الإصابة ، وبعد الجراحة مباشرة ، وبعد 48 ساعة من الجراحة (الشكل 2 ، الجدول 2 ، الجدول 3 ، والجدول 4).

1. ضع قطب التأريض تحت جلد الطرف السفلي الأيسر.
2. أدخل قطب التسجيل (قطب إبرة ثنائي القطب متحد المركز) في الجانب المصاب من عضلة المجسات ، بعمق اختراق 5 مم.
3. ضع قطب التحفيز (قطب إبرة متحد المركز) على غشاء العصب الوجهي. تحفيز الأطراف القريبة والبعيدة من العصب الوجهي المصاب بشكل منفصل.
4. استخدم تيار نبضة موجة مربعة بتردد 1 هرتز ، وعرض موجة 0.1 مللي ثانية ، ونطاق ترشيح من 10-3000 هرتز.
5. استخدم محفزات 2 مللي أمبير و 5 مللي أمبير و 10 مللي أمبير و 15 مللي أمبير و 20 مللي أمبير للحث على توليد جهد عمل العضلات المركب.
6. سجل زمن الوصول (Lm) وذروة السعة (Am) للموجة M.
   ملاحظة: تشير الموجة M إلى الشكل الموجي الأول والأكثر وضوحا المسجل. النقطة التي يترك فيها شكل الموجة خط الأساس هي نقطة البداية لشكل الموجة. المسافة من نقطة بداية خط الأساس إلى نقطة بداية شكل الموجة هي Lm. المسافة بين أعلى وأدنى قمم الشكل الموجي هي Am.
7. اترك فاصلا زمنيا مدته 5 دقائق بين كل تحفيز لضمان تعافي الأعصاب.

5. الفحص النسيجي

1. بعد الانتهاء من اختبارات الفيزيولوجيا الكهربية ، استخدم ملاقط دقيقة لرفع العصب والمقص الدقيق لقطع عينة العصب. تشمل العينة جذع العصب الوجهي من نقطة الإصابة إلى الغدة النكفية ، وهي الألياف العصبية في الطرف البعيد من نقطة الإصابة ، بطول إجمالي يبلغ حوالي 0.5 سم.
2. قم بإصلاح عينة العصب في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة وقم بإعداد أقسام مدمجة في البارافين¹⁶.
3. قم بتلطيخ الأقسام باستخدام طريقة تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E)¹⁶ واحصل على صور بتكبير 100x و 400x باستخدام مجهر فوتوغرافي بصري (الشكل 3).
   ملاحظة: بعد إزالة العينة العصبية وخياطة الجلد تحت التخدير ، تم القتل الرحيم للفئران بواسطة البنتوباربيتال الصوديوم (150 مجم / كجم ؛ IP).

النتائج

الاختبار السلوكي
قبل الجراحة ، كانت درجات رد الفعل الوامض وحركة الججس وموضع طرف الأنف 0 نقطة في جميع الفئران التجريبية ، مما يشير إلى أن جميع الفئران لديها وظيفة العصب الوجهي سليمة. في تقييم وظيفة العصب الوجهي بعد 48 ساعة من الجراحة, وجد أن الدرجات الفردية للفئر...

Discussion

من الضروري دراسة آلية إصلاح إصابة العصب الوجهي لدى المرضى الذين يعانون من شلل الوجه مجهول^{السبب 17}. يجب أن تفي درجة نموذج إصابة العصب الوجهي بالمتطلبات التالية. أولا ، يجب ألا تكون درجة إصابة العصب الوجهي خفيفة جدا ، مثل درجة سندرلاند من الدرجة^{1 ، وال...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS