Istituzione di un modello di ratto con lesione del nervo facciale per la ricerca sulla paralisi facciale idiopatica

Riepilogo

Il presente protocollo stabilisce un modello di ratto con lesione del nervo facciale utilizzando la microscopia per studiare i meccanismi diagnostici e terapeutici della paralisi facciale idiopatica.

Abstract

La paralisi facciale idiopatica è il tipo più comune di lesione del nervo facciale, rappresentando circa il 70% dei casi di paralisi facciale periferica. Questa malattia non solo può portare a un cambiamento nell'espressione facciale, ma ha anche un grande impatto sulla psicologia dei pazienti. Nei casi più gravi, può influire sul normale lavoro e sulla vita dei pazienti. Pertanto, la ricerca sulla riparazione delle lesioni del nervo facciale ha un importante significato clinico. Al fine di studiare il meccanismo di questa malattia, è necessario effettuare esperimenti su animali pertinenti, tra i quali il compito più importante è quello di stabilire un modello animale con la stessa patogenesi della malattia umana. La compressione del nervo facciale all'interno dell'osso petroso, in particolare del tronco nervoso alla giunzione dell'estremità distale del canale uditivo interno e del segmento labirintico, è la patogenesi della paralisi facciale idiopatica. Al fine di simulare questa malattia comune, in questo studio è stato stabilito un modello di lesione da compressione del segmento extracranico principale del nervo facciale. Il danno neurologico è stato valutato mediante esame comportamentale, neuroelettrofisiologico e istologico. Infine, una forza costante di 50 g e una lesione del morsetto di 90 s sono stati selezionati come parametri di lesione per costruire un modello stabile di paralisi facciale idiopatica.

Introduzione

Come tipo di paralisi facciale periferica, la paralisi facciale idiopatica è caratteristica di eziologia sconosciuta, insorgenza acuta e decorso autolimitante ^1,2. L'eziologia e la patogenesi della paralisi facciale idiopatica sono ancora incerte³. Attualmente, esistono vari metodi di trattamento per la paralisi facciale⁴ e la diversità dei trattamenti riflette la mancanza di opzioni di trattamento ottimali. L'utilizzo di tecniche di biologia cellulare e molecolare per studiare il meccanismo della lesione del nervo facciale è la base per stabilire metodi di trattamento efficaci per la paralisi facciale. Pertanto, un modello di lesione del nervo facciale adatto e stabile è particolarmente importante.

Al momento, non esiste un metodo standard per stabilire un modello di lesione del nervo facciale. Gli attuali metodi di preparazione includono l'inoculazione del virus⁵, la transezione⁶, la stimolazione a freddo⁷ e la compressione⁸. Si ritiene che l'infezione virale, il vasospasmo neurotrofoblastico, l'infiammazione autoimmune, ecc., possano causare ischemia locale, degenerazione ed edema del nervo facciale ^9,10,11. Inoltre, tutti i fattori di cui sopra possono causare la compressione del tronco principale del nervo facciale nello stretto canale del nervo facciale osseo^12,13. Inoltre, le lesioni più comuni dei nervi periferici identificate durante le procedure chirurgiche erano la compressione e la contusione¹⁴. Sulla base delle teorie e dei fenomeni clinici di cui sopra, riteniamo che la preparazione del modello di lesione del nervo facciale attraverso la lesione da compressione sia più ragionevole. Tuttavia, la maggior parte dei metodi attuali per l'implementazione delle lesioni da compressione non fornisce parametri quantitativi di forza e tempo. In questo studio, abbiamo quantificato la forza e la durata della lesione da compressione per migliorare la riproducibilità del modello stabilito.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e supervisionati dal Comitato etico animale dell'ospedale Xinhua affiliato alla Shanghai Jiaotong University School of Medicine (XHEC-F-2023-061). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley, 200-300 g. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). I ratti sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (n = 10): gruppo di chirurgia fittizia, gruppo di lesioni di 30 secondi, gruppo di lesioni di 60 secondi e gruppo di lesioni di 90 secondi.

1. Induzione dell'anestesia e preparazione animale

1. Indossare i seguenti dispositivi di protezione individuale (DPI): mascherina chirurgica, guanti chirurgici, camice monouso.
2. Pesare i ratti e anestetizzarli con ketamina cloridrato alla dose di 50 mg/kg per iniezione intraperitoneale (i.p.). Somministrare meloxicam (5 mg/kg; i.p.) per l'analgesia perioperatoria. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico per le dita dei piedi.
3. Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
4. Dopo l'anestesia, posizionare i ratti in posizione prona e fissare la testa in modo che il lato sinistro del viso sia rivolto verso l'alto. Radere i peli dietro l'orecchio sinistro e disinfettare la pelle. Copri il ratto con il telo chirurgico sterile.

2. Stabilire un modello di lesione da schiacciamento locale del tronco extracranico del nervo facciale

NOTA: Sterilizzare tutte le apparecchiature prima dell'uso. Tutte le operazioni sono state eseguite in sala operatoria.

1. Praticare un'incisione longitudinale lunga 2 cm dietro l'orecchio sinistro e sezionare la pelle e il tessuto sottocutaneo per separare lo spazio naturale tra i muscoli facciali e cervicali.
2. Utilizzare micro pinzette e micro forbici per dissociare completamente il tronco del nervo facciale tra il forame stilomastoideo e la ghiandola parotide, con una lunghezza esposta di circa 1 cm.
3. Utilizzare una pinza quantitativa per lesioni ai nervi periferici (Tabella dei materiali) per bloccare il tronco del nervo facciale in modo che causi lesioni. Localizzare il sito della lesione a 0,5 cm di distanza dal forame stilomastoideo. Applicare un'intensità di infortunio di 50 g e un tempo di recupero rispettivamente di 30 s, 60 s e 90 s.
4. Sutura il sottocutaneo e la pelle con filo di seta. Disinfettare l'incisione.
5. Per i ratti nel gruppo di controllo della chirurgia fittizia, tagliare la pelle e il tessuto sottocutaneo dopo l'anestesia ed esporre e separare il corrispondente tronco principale del nervo facciale. Successivamente, suturato immediatamente l'incisione.
6. Monitorare la salute dell'animale, mantenere la decubito sternale e mantenerlo in condizioni di caldo.
7. Sposta il ratto di nuovo nella gabbia di alloggiamento dopo che il ratto è cosciente.

3. Test comportamentali

NOTA: La funzione del nervo facciale dei ratti è stata valutata prima dell'intervento chirurgico e 48 ore dopo l'intervento chirurgico (Figura 1). I punteggi del riflesso del battito di ciglia, del movimento del palpo e della posizione della punta nasale sono stati calcolati¹⁵. Più alto è il punteggio totale, più grave è il grado di lesione del nervo facciale (Tabella 1).

1. Riflesso di chiusura (BR):
   1. Collegare un ago da 18 G a una siringa da 2 ml e soffiare aria nell'occhio del ratto da una distanza di 2 cm. Osservare il movimento e la chiusura delle palpebre.
   2. Punteggio in base ai seguenti criteri: Nessuna differenza significativa da entrambe le parti: 0 punti; Chiusura ritardata del lato interessato rispetto al lato sano: 1 punto; Incapacità di chiudere la palpebra interessata: 2 punti.
2. Movimento Vibrisse (VM):
   1. Conta i movimenti bilaterali dei tentacoli dei ratti entro 30 s.
   2. Punteggio secondo i seguenti criteri: Nessuna differenza significativa nel movimento bilaterale dei tentacoli: 0 punti; Il movimento dei baffi del lato interessato è più debole di quello del lato sano: 1 punto; Perdita del movimento dei baffi sul lato interessato: 2 punti.
3. Posizione della punta nasale.
   1. Punta centrale del naso: 0 punti; Punta del naso inclinata verso il lato sano: 1 punto.
      NOTA: Un punteggio totale di 0 punti indica normale, 1-2 punti indicano una lieve paralisi facciale (paresi), 3-4 punti indicano un'evidente paralisi facciale (paresi) e 5 punti indicano una paralisi facciale completa¹⁵.

4. Rilevazione neuroelettrofisiologica

NOTA: L'elettrografia facciale (ENoG) è stata eseguita prima dell'infortunio, immediatamente dopo l'intervento chirurgico e 48 ore dopo l'intervento (Figura 2, Tabella 2, Tabella 3 e Tabella 4).

1. Posizionare l'elettrodo di messa a terra sotto la pelle dell'arto inferiore sinistro.
2. Inserire l'elettrodo di registrazione (elettrodo ad ago concentrico bipolare) nel lato leso del muscolo tentacolare, con una profondità di penetrazione di 5 mm.
3. Posizionare l'elettrodo di stimolazione (elettrodo ad ago concentrico) sulla membrana del nervo facciale. Stimolare separatamente le estremità prossimale e distale del nervo facciale danneggiato.
4. Utilizzare una corrente di impulso a onda quadra con una frequenza di 1 Hz, un'ampiezza d'onda di 0,1 ms e un intervallo di filtraggio di 10-3000 Hz.
5. Utilizzare stimoli di 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA e 20 mA per indurre la generazione di potenziale d'azione muscolare composto.
6. Registra la latenza (Lm) e l'ampiezza di picco (Am) dell'onda M.
   NOTA: L'onda M si riferisce alla prima e più evidente forma d'onda registrata. Il punto in cui la forma d'onda lascia la linea di base è il punto iniziale della forma d'onda. La distanza dal punto di partenza della linea di base al punto di partenza della forma d'onda è Lm. La distanza tra i picchi più alti e più bassi della forma d'onda è Am.
7. Consentire un intervallo di 5 minuti tra ogni stimolazione per garantire il recupero dei nervi.

5. Esame istologico

1. Dopo aver completato i test elettrofisiologici, utilizzare micro pinzette per sollevare il nervo e micro forbici per tagliare il campione di nervo. Il campione comprende il tronco del nervo facciale dal punto della lesione alla ghiandola parotide, che è la fibra nervosa all'estremità distale del punto della lesione, con una lunghezza totale di circa 0,5 cm.
2. Fissare il campione nervoso in paraformaldeide al 4% per 24 ore e preparare le sezioni¹⁶ incluse in paraffina.
3. Colorare le sezioni con il metodo di colorazione ematossilina-eosina (H&E)¹⁶ e acquisire immagini con ingrandimento di 100x e 400x utilizzando un microscopio ottico fotografico (Figura 3).
   NOTA: Dopo aver rimosso il campione nervoso e suturato la pelle in anestesia, i ratti sono stati soppressi con pentobarbital sodico (150 mg/kg; i.p.).

Risultati

Test comportamentali
Prima dell'intervento chirurgico, i punteggi del riflesso del battito delle palpebre, del movimento del palpo e della posizione della punta nasale erano di 0 punti in tutti i ratti sperimentali, indicando che tutti i ratti avevano una funzione del nervo facciale intatta. Nella valutazione della funzione del nervo facciale 48 ore dopo l'intervento chirurgico, è stato riscontrato che i punteggi individuali dei ratti in ciascun gruppo di lesione era...

Discussione

È necessario studiare il meccanismo di riparazione della lesione del nervo facciale nei pazienti con paralisi facciale idiopatica¹⁷. Il modello del grado di lesione del nervo facciale deve soddisfare i seguenti requisiti. In primo luogo, il grado di lesione del nervo facciale non dovrebbe essere troppo lieve, come il Sunderland Grade 1^st degree¹⁸, che può autoripararsi completamente senza l'intervento di farmaci. In secondo luo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS