Создание модели травмы лицевого нерва на крысе для исследований идиопатического паралича лицевого нерва

Резюме

В настоящем протоколе создана модель крысы с повреждением лицевого нерва с использованием микроскопии для исследования диагностических и терапевтических механизмов идиопатического паралича лицевого нерва.

Аннотация

Идиопатический паралич лицевого нерва является наиболее распространенным типом повреждения лицевого нерва, на долю которого приходится примерно 70% случаев периферического паралича лицевого нерва. Это заболевание может не только привести к изменению выражения лица, но и сильно повлиять на психологию пациентов. В тяжелых случаях это может повлиять на нормальную работу и жизнь пациентов. Таким образом, исследования по восстановлению повреждений лицевого нерва имеют важное клиническое значение. Для того чтобы изучить механизм возникновения этого заболевания, необходимо провести соответствующие эксперименты на животных, среди которых важнейшей задачей является установление животной модели с таким же патогенезом, как у человека. Сдавливание лицевого нерва в каменистой кости, особенно нервного ствола на стыке дистального конца внутреннего слухового прохода и лабиринтного сегмента, является патогенезом идиопатического паралича лицевого нерва. Для того, чтобы смоделировать это распространенное заболевание, в данном исследовании была создана модель компрессионной травмы основного экстракраниального сегмента лицевого нерва. Неврологические повреждения оценивали с помощью поведенческого, нейроэлектрофизиологического и гистологического исследования. Наконец, постоянная сила 50 g и травма зажимом 90 с были выбраны в качестве параметров травмы для построения стабильной модели идиопатического паралича лицевого нерва.

Введение

Идиопатический паралич лицевого нерва характерен как разновидность периферического паралича лицевого нерва неясной этиологии, острого начала и самоограничивающегося течения ^1,2. Этиология и патогенез идиопатического паралича лицевого нерва до сих пор неясны³. В настоящее время существуют различные методы лечения паралича лицевого нерва⁴, и разнообразие методов лечения отражает отсутствие оптимальных вариантов лечения. Использование методов клеточной и молекулярной биологии для изучения механизма повреждения лицевого нерва является основой для создания эффективных методов лечения паралича лицевого нерва. Поэтому особенно важна подходящая и стабильная модель повреждения лицевого нерва.

В настоящее время не существует стандартного метода для создания модели повреждения лицевого нерва. В настоящее время к методам подготовки относятся инокуляция вируса⁵, транссекция⁶, холодная стимуляция⁷ и компрессия⁸. Считается, что вирусная инфекция, нейротрофобластический вазоспазм, аутоиммунное воспаление и т.д. могут вызывать местную ишемию, дегенерацию и отек лицевого нерва ^9,10,11. Более того, все вышеперечисленные факторы могут вызвать сдавливание основного ствола лицевого нерва в узком костном канале лицевого нерва^12,13. Кроме того, наиболее распространенными повреждениями периферических нервов, выявленными во время хирургических процедур, были компрессия и контузия¹⁴. Основываясь на вышеизложенных теориях и клинических явлениях, мы считаем, что подготовка модели повреждения лицевого нерва через компрессионную травму является более целесообразной. Однако большинство современных методов реализации компрессионных травм не дают количественных параметров силы и времени. В этом исследовании мы количественно оценили силу и продолжительность компрессионной травмы для улучшения воспроизводимости созданной модели.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены и контролировались Комитетом по этике животных больницы Синьхуа при Медицинской школе Шанхайского университета Цзяотун (XHEC-F-2023-061). Для настоящего исследования использовались самцы крыс Sprague-Dawley, 200-300 г. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Крысы были случайным образом разделены на четыре группы (n = 10): группа фиктивной хирургии, группа 30-й травмы, группа 60-й травмы и группа 90-й травмы.

1. Индукция анестезии и подготовка животных

1. Носите следующие средства индивидуальной защиты (СИЗ): хирургическая маска, хирургические перчатки, одноразовый халат.
2. Утяжеляют крыс и обезболивают их кетамина гидрохлоридом в дозе 50 мг/кг путем внутрибрюшинного (в/в) введения. Назначают мелоксикам (5 мг/кг; внутримышечно) для периоперационной анальгезии. Подтвердите глубину анестезии с помощью зажима пальца ноги.
3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание.
4. После анестезии поместите крыс в положение лежа и зафиксируйте голову так, чтобы левая сторона лица была вверх. Сбрейте волосы за левым ухом и продезинфицируйте кожу. Накройте крысу стерильной хирургической простыней.

2. Создание модели локальной травмы раздавливания экстракраниального ствола лицевого нерва

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте все оборудование перед использованием. Все операции проводились в операционной.

1. Сделайте продольный разрез длиной 2 см за левым ухом и рассеките кожу и подкожную клетчатку, чтобы отделить естественный зазор между лицевыми и шейными мышцами.
2. С помощью микропинцета и микроножниц полностью диссоциируйте ствол лицевого нерва между шиломастоидным отверстием и околоушной железой, с открытой длиной около 1 см.
3. Используйте щипцы для количественного повреждения периферических нервов (Таблица материалов) для зажима ствола лицевого нерва и причинения травмы. Место повреждения расположите на расстоянии 0,5 см от шиломастоидного отверстия. Применяйте интенсивность травмы 50 g и время травмы 30 с, 60 с и 90 с соответственно.
4. Сшивайте подкожную клетчатку и кожу шелковой нитью. Продезинфицируйте разрез.
5. У крыс в контрольной группе симуляционной хирургии разрезают кожу и подкожную клетчатку после анестезии, а также обнажают и отделяют соответствующий главный ствол лицевого нерва. Далее сразу же зашивается разрез.
6. Следите за здоровьем животного, поддерживайте лежачее положение грудины, содержите его в теплых условиях.
7. Переместите крысу обратно в клетку после того, как крыса придет в сознание.

3. Поведенческое тестирование

Примечание: Функция лицевого нерва крыс оценивалась до операции и через 48 ч после операции (Рисунок 1). Баллы по рефлексу моргания, пальп-движению и положению кончика носа были рассчитаны¹⁵. Чем выше общий балл, тем тяжелее степень повреждения лицевого нерва (табл. 1).

1. Мигающий рефлекс (BR):
   1. Прикрепите иглу 18 г к шприцу объемом 2 мл и вдуйте воздух в глаз крысы с расстояния 2 см. Наблюдайте за движением век и их закрытием.
   2. Оценка по следующим критериям: Без существенной разницы с обеих сторон: 0 баллов; Позднее закрытие пораженной стороны по сравнению со здоровой: 1 балл; Невозможность закрыть пораженное веко: 2 балла.
2. Вибриссы (ВМ):
   1. Подсчитайте двусторонние движения щупалец крыс в течение 30 с.
   2. Оценка по следующим критериям: Нет существенной разницы в двустороннем движении щупалец: 0 баллов; Движение усов пораженной стороны слабее, чем у здоровой: на 1 балл; Потеря движения усов на пораженной стороне: 2 балла.
3. Положение кончика носа.
   1. Центральный кончик носа: 0 баллов; Наклон кончика носа в здоровую сторону: 1 балл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общая оценка 0 баллов указывает на норму, 1-2 балла указывает на легкий паралич лицевого нерва (парез), 3-4 балла указывает на явный паралич лицевого нерва (парез), а 5 баллов указывает на полный паралич лицевого нерва¹⁵.

4. Нейроэлектрофизиологическое обнаружение

ПРИМЕЧАНИЕ: Лицевая электрография (ЭНог) проводилась до травмы, сразу после операции и через 48 ч после операции (Рисунок 2, Таблица 2, Таблица 3 и Таблица 4).

1. Поместите заземляющий электрод под кожу левой нижней конечности.
2. Введите записывающий электрод (биполярный концентрический игольчатый электрод) в поврежденную сторону мышцы-щупальца, с глубиной проникновения 5 мм.
3. Поместите электрод для стимуляции (концентрический игольчатый электрод) на мембрану лицевого нерва. Стимулируйте проксимальный и дистальный концы поврежденного лицевого нерва отдельно.
4. Используйте прямоугольный импульсный ток с частотой 1 Гц, шириной волны 0,1 мс и диапазоном фильтрации 10-3000 Гц.
5. Используйте стимулы 2 мА, 5 мА, 10 мА, 15 мА и 20 мА, чтобы вызвать генерацию сложного потенциала мышечного действия.
6. Запишите задержку (Lm) и пиковую амплитуду (Am) M-волны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: М-волна относится к первой и наиболее очевидной зарегистрированной форме волны. Точка, в которой осциллограмма выходит за пределы базовой линии, является начальной точкой осциллограммы. Расстояние от начальной точки базовой линии до начальной точки формы сигнала равно Lm. Расстояние между самым высоким и самым низким пиками формы волны равно Am.
7. Делайте 5-минутный интервал между каждой стимуляцией, чтобы обеспечить восстановление нервов.

5. Гистологическое исследование

1. После завершения электрофизиологических тестов используйте микропинцет для подъема нерва и микроножницы для разрезания образца нерва. Образец включает в себя ствол лицевого нерва от места повреждения до околоушной железы, которая представляет собой нервное волокно на дистальном конце места повреждения, общей длиной около 0,5 см.
2. Зафиксируйте образец нерва в 4% параформальдегиде на 24 ч и приготовьте срезы, содержащие парафин¹⁶.
3. Окрашивайте срезы методом окрашивания гематоксилин-эозином (H&E)¹⁶ и получайте изображения с 100-кратным и 400-кратным увеличением с помощью оптического фотографического микроскопа (рис. 3).
   Примечание: После удаления образца нерва и наложения швов на кожу под анестезией, крыс усыпляли пентобарбиталом натрия (150 мг/кг; внутримышечно).

Результаты

Поведенческое тестирование
До операции показатели мигательного рефлекса, пальп-движений и положения кончика носа составляли 0 баллов у всех экспериментальных крыс, что указывает на то, что у всех крыс функция лицевого нерва не повреждена. При оценке функци...

Обсуждение

Необходимо изучить механизм восстановления повреждения лицевого нерва у пациентов с идиопатическим параличом лицевого нерва¹⁷. Степень повреждения модели лицевого нерва должна соответствовать следующим требованиям. Во-первых, степень повреждения лице...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS