建立用于特发性面神经麻痹研究的面神经损伤大鼠模型

摘要

本方案使用显微镜建立了面神经损伤大鼠模型，以研究特发性面瘫的诊断和治疗机制。

摘要

特发性面神经麻痹是最常见的面神经损伤类型，约占周围面神经麻痹病例的 70%。这种疾病不仅会导致面部表情的变化，还会极大地影响患者的心理。在严重的情况下，它会影响患者的正常工作和生活。因此，面神经损伤修复的研究具有重要的临床意义。为了研究这种疾病的机制，有必要进行相关的动物实验，其中最重要的任务是建立与人类疾病具有相同发病机制的动物模型。岩骨内的面神经受压，尤其是内耳道远端与迷路段交界处的神经干，是特发性面神经麻痹的发病机制。为了模拟这种常见疾病，本研究建立了面神经主要颅外段的压迫性损伤模型。通过行为、神经电生理和组织学检查评估神经损伤。最后，选取 50 g 恒力和 90 s 夹伤作为损伤参数，构建稳定的特发性面神经麻痹模型。

引言

作为一种周围性面神经麻痹，特发性面神经麻痹具有病因不明、急性发作和自限性病程的特征 ^1,2。特发性面瘫的病因和发病机制仍不确定³.目前，面瘫⁴ 的治疗方法多种多样，治疗方法的多样性反映了缺乏最佳治疗方案。使用细胞和分子生物学技术研究面神经损伤的机制是建立面神经麻痹有效治疗方法的基础。因此，一个合适且稳定的面神经损伤模型尤为重要。

目前，尚无建立面神经损伤模型的标准方法。目前的制备方法包括病毒接种⁵（virus suculation）、横断^面6（transection 6）、冷刺激7（cold stimulation）^和压缩8（compression^）方法。据信，病毒感染、神经滋养细胞血管痉挛、自身免疫性炎症等都可能导致面神经局部缺血、变性和水肿 ^9,10,11。此外，上述所有因素都会导致狭窄的骨面神经管中面神经的主干受压^12,13。此外，外科手术中发现的最常见的周围神经损伤是压迫和挫伤¹⁴。基于上述理论和临床现象，我们认为通过压迫损伤制备面神经损伤模型更为合理。然而，目前大多数实施压迫性损伤的方法都没有提供力和时间的定量参数。在这项研究中，我们量化了压迫损伤的力和持续时间，以提高已建立模型的可重复性。

研究方案

所有动物实验均由上海交通大学医学院附属新华医院动物伦理委员会 （XHEC-F-2023-061） 批准和监督。本研究使用 Sprague-Dawley 雄性大鼠 200-300 g。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。将大鼠随机分为 4 组 （n = 10）：假手术组、30 s 损伤组、60 s 损伤组和 90 s 损伤组。

1. 麻醉诱导和动物准备

1. 佩戴以下个人防护装备 （PPE）：外科口罩、外科手套、一次性防护服。
2. 给大鼠称重，并通过腹膜内 （ip） 注射用 50 mg/kg 剂量的盐酸氯胺酮麻醉它们。施用美洛昔康 （5 mg/kg;ip） 用于围手术期镇痛。用脚趾捏确认麻醉深度。
3. 在双眼涂抹眼膏以防止干燥。
4. 麻醉后，将大鼠置于俯卧位并固定头部，使面部左侧向上。剃掉左耳后面的毛发并对皮肤进行消毒。用无菌手术单盖住大鼠。

2. 建立面神经颅外干局部挤压伤模型

注意： 使用前对所有设备进行消毒。所有手术均在手术室进行。

1. 在左耳后方做一个 2 厘米长的纵向切口，解剖皮肤和皮下组织，以分离面部肌肉和颈椎肌肉之间的自然间隙。
2. 使用微镊和微剪刀将茎突孔和腮腺之间的面神经干完全分离，外露长度约为 1 厘米。
3. 使用周围神经定量损伤钳（材料表）夹住面神经干造成损伤。找到距离茎突孔 0.5 cm 的损伤部位。施加 50 g 的损伤强度和 30 s、60 s 和 90 s 的损伤时间。
4. 用丝线缝合皮下和皮肤。对切口进行消毒。
5. 对于假手术对照组的大鼠，麻醉后切开皮肤和皮下组织，暴露并分离相应的面神经主干。接下来，立即缝合切口。
6. 监测动物的健康状况，保持胸骨卧位，并将其保持在温暖的环境中。
7. 老鼠清醒后，将老鼠移回笼子。

3. 行为测试

注意：手术前和手术后 48 小时评估大鼠的面神经功能（图 1）。计算眨眼反射、触诊运动和鼻尖位置的分数¹⁵。总分越高，面神经损伤程度越严重（表1）。

1. 眨眼反射 （BR）：
   1. 将 18 G 针头连接到 2 mL 注射器上，然后从 2 cm 的距离将空气吹入大鼠的眼睛。观察眼睑运动和闭合。
   2. 根据以下标准得分： 双方无显著差异：0 分;与健康侧相比，患侧闭合延迟：1 分;无法闭合受影响的眼睑：2 分。
2. 弧菌运动 （VM）：
   1. 计算大鼠在 30 秒内的双侧触手运动。
   2. 根据以下标准评分： 双侧触手运动无显著差异：0 分;患侧胡须的运动比健康侧弱：1 分;患侧胡须运动丧失：2 分。
3. 鼻尖位置。
   1. 中央鼻尖：0 分;鼻尖向健康的一侧倾斜：1 分。
      注：总分 0 分表示正常，1-2 分表示轻度面瘫（麻痹），3-4 分表示明显的面神经麻痹（麻痹），5 分表示完全面瘫¹⁵。

4. 神经电生理学检测

注意：在受伤前、手术后立即和手术后 48 小时进行面电图 （ENoG）（图 2、 表 2、表 3 和 表 4）。

1. 将接地电极放在左下肢的皮肤下。
2. 将记录电极（双极同心针电极）插入触手肌受伤侧，穿透深度为 5 mm。
3. 将刺激电极（同心针电极）放在面神经膜上。分别刺激受伤面神经的近端和远端。
4. 使用频率为 1 Hz、波宽为 0.1 ms、滤波范围为 10-3000 Hz 的方波脉冲电流。
5. 使用 2 mA、5 mA、10 mA、15 mA 和 20 mA 的刺激来诱导复合肌肉动作电位的产生。
6. 记录 M 波的延迟 （Lm） 和峰值幅度 （Am）。
   注意：M 波是指记录的第一个也是最明显的波形。波形离开基线的点是波形的起点。从基线起点到波形起点的距离为 Lm。波形的最高峰值和最低峰值之间的距离为 Am。
7. 每次刺激之间留出 5 分钟的间隔，以确保神经恢复。

5. 组织学检查

1. 完成电生理测试后，使用微型镊子提起神经，用微型剪刀切割神经标本。标本包括从伤点到腮腺的面神经干，腮腺是伤点远端的神经纤维，总长约 0.5 cm。
2. 将神经标本在 4% 多聚甲醛中固定 24 小时，并制备石蜡包埋的切片¹⁶。
3. 用苏木精 - 伊红染色 （H&E） 方法¹⁶ 对切片进行染色，并使用光学照相显微镜以 100 倍和 400 倍放大倍率获取图像（图 3）。
   注：取出神经标本并在麻醉下缝合皮肤后，用戊巴比妥钠 （150 mg/kg; ip） 对大鼠实施安乐死。

结果

行为测试
术前，所有实验大鼠的眨眼反射、触诊运动和鼻尖位置评分均为 0 分，表明所有大鼠面神经功能完整。术后 48 h 面神经功能评估发现各损伤组大鼠个体评分升高。此外，随着面神经损伤时间的延长，总分逐渐增加（表1）。

术后 48 h 各组大鼠的面部活动记录显示，随着损伤时间的延长，面部对称性逐渐消失。在 30 ...

讨论

有必要研究特发性面神经麻痹患者面神经损伤的修复机制¹⁷.面神经损伤程度模型应满足以下要求。首先，面神经损伤的程度不宜太轻，如桑德兰 1 级^{18 度，}无需药物干预即可完全自我修复。其次，它不应该太严重，例如桑德兰 5 度，需要手术干预。第三，面神经损伤的程度应稳定均匀。因此，将行为、电生理和组织学测试作为?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS