Établissement d’un modèle de rat sur les lésions du nerf facial pour la recherche sur la paralysie faciale idiopathique

Résumé

Le présent protocole établit un modèle de rat de lésion du nerf facial utilisant la microscopie pour étudier les mécanismes diagnostiques et thérapeutiques de la paralysie faciale idiopathique.

Résumé

La paralysie faciale idiopathique est le type le plus courant de lésion du nerf facial, représentant environ 70 % des cas de paralysie faciale périphérique. Cette maladie peut non seulement entraîner un changement dans l’expression faciale, mais aussi avoir un impact considérable sur la psychologie des patients. Dans les cas graves, elle peut affecter le travail et la vie normaux des patients. Par conséquent, la recherche sur la réparation des lésions du nerf facial a une importance clinique importante. Afin d’étudier le mécanisme de cette maladie, il est nécessaire de réaliser des expériences animales pertinentes, parmi lesquelles la tâche la plus importante est d’établir un modèle animal avec la même pathogenèse que la maladie humaine. La compression du nerf facial à l’intérieur de l’os pétreux, en particulier du tronc nerveux à la jonction de l’extrémité distale du conduit auditif interne et du segment labyrinthique, est la pathogenèse de la paralysie faciale idiopathique. Afin de simuler cette maladie courante, un modèle de blessure par compression du segment extracrânien principal du nerf facial a été établi dans cette étude. Les dommages neurologiques ont été évalués par un examen comportemental, neuroélectrophysiologique et histologique. Enfin, une force constante de 50 g et une blessure par pince de 90 s ont été sélectionnées comme paramètres de blessure pour construire un modèle stable de paralysie faciale idiopathique.

Introduction

En tant que type de paralysie faciale périphérique, la paralysie faciale idiopathique est caractéristique d’étiologie inconnue, d’apparition aiguë et d’évolution auto-résolutive ^1,2. L’étiologie et la pathogenèse de la paralysie faciale idiopathique sont encore incertaines³. À l’heure actuelle, il existe différentes méthodes de traitement de la paralysie faciale4^{, et} la diversité des traitements reflète le manque d’options de traitement optimales. L’utilisation de techniques de biologie cellulaire et moléculaire pour étudier le mécanisme des lésions du nerf facial est la base de l’établissement de méthodes de traitement efficaces de la paralysie faciale. Par conséquent, un modèle de lésion du nerf facial adapté et stable est particulièrement important.

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode standard pour établir un modèle de lésion du nerf facial. Les méthodes de préparation actuelles comprennent l’inoculation du virus⁵, la transection⁶, la stimulation par le froid⁷ et la compression⁸. On pense que l’infection virale, le vasospasme neurotrophoblastique, l’inflammation auto-immune, etc., peuvent tous provoquer une ischémie locale, une dégénérescence et un œdème du nerf facial ^9,10,11. De plus, tous les facteurs ci-dessus peuvent provoquer une compression du tronc principal du nerf facial dans le canal étroit du nerf facial osseux^12,13. De plus, les lésions des nerfs périphériques les plus courantes identifiées lors des interventions chirurgicales étaient la compression et la contusion¹⁴. Sur la base des théories et des phénomènes cliniques ci-dessus, nous pensons qu’il est plus raisonnable de préparer le modèle de lésion du nerf facial par compression. Cependant, la plupart des méthodes actuelles de mise en œuvre des blessures par compression ne fournissent pas de paramètres quantitatifs de force et de temps. Dans cette étude, nous avons quantifié la force et la durée de la lésion par compression afin d’améliorer la reproductibilité du modèle établi.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées et supervisées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital Xinhua affilié à la faculté de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai (XHEC-F-2023-061). Des rats mâles Sprague-Dawley, de 200 à 300 g, ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières). Les rats ont été divisés au hasard en quatre groupes (n = 10) : le groupe de chirurgie simulée, le groupe de blessures de 30 ans, le groupe de blessures de 60 ans et le groupe de blessures de 90 ans.

1. Induction de l’anesthésie et préparation des animaux

1. Portez l’équipement de protection individuelle (EPI) suivant : masque chirurgical, gants chirurgicaux, blouse jetable.
2. Pesez les rats et anesthésiez-les avec du chlorhydrate de kétamine à une dose de 50 mg/kg par injection intrapéritonéale (i.p.). Administrer du méloxicam (5 mg/kg ; i.p.) pour l’analgésie périopératoire. Confirmez la profondeur de l’anesthésie à l’aide d’un pincement des orteils.
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement.
4. Après l’anesthésie, placez les rats en position couchée et fixez la tête de manière à ce que le côté gauche du visage soit vers le haut. Rasez les poils derrière l’oreille gauche et désinfectez la peau. Couvrez le rat avec le champ chirurgical stérile.

2. Etablir un modèle local de lésion par écrasement du tronc extracrânien du nerf facial

REMARQUE : Stérilisez tout l’équipement avant utilisation. Toutes les opérations ont été effectuées dans la salle d’opération.

1. Faites une incision longitudinale de 2 cm de long derrière l’oreille gauche et disséquez la peau et le tissu sous-cutané pour séparer l’espace naturel entre les muscles faciaux et cervicaux.
2. À l’aide d’une micropince à épiler et de micro-ciseaux, désolidarisez complètement le tronc du nerf facial entre le foramen stylomastoïdien et la glande parotide, avec une longueur exposée d’environ 1 cm.
3. Utilisez une pince quantitative pour lésions des nerfs périphériques (Table des matériaux) pour serrer le tronc du nerf facial afin de causer des blessures. Localisez le site de la blessure à 0,5 cm du foramen stylomastoïdien. Appliquez une intensité de blessure de 50 g et un temps de blessure de 30 s, 60 s et 90 s, respectivement.
4. Suturez la peau sous-cutanée avec du fil de soie. Désinfectez l’incision.
5. Pour les rats du groupe témoin de chirurgie simulée, coupez la peau et le tissu sous-cutané après l’anesthésie et exposez et séparez le tronc principal correspondant du nerf facial. Ensuite, suturez immédiatement l’incision.
6. Surveillez la santé de l’animal, maintenez le décubitus sternal et maintenez-le dans des conditions chaudes.
7. Ramenez le rat dans la cage d’hébergement une fois qu’il est conscient.

3. Tests comportementaux

REMARQUE : La fonction du nerf facial des rats a été évaluée avant la chirurgie et 48 h après la chirurgie (figure 1). Les scores du réflexe de clignement, du mouvement des palpes et de la position de la pointe nasale ont été calculés¹⁵. Plus le score total est élevé, plus le degré de lésion du nerf facial est grave (tableau 1).

1. Réflexe de clignement des yeux (BR) :
   1. Fixez une aiguille de 18 g à une seringue de 2 ml et soufflez de l’air dans l’œil du rat à une distance de 2 cm. Observez le mouvement et la fermeture de la paupière.
   2. Note selon les critères suivants : Pas de différence significative des deux côtés : 0 point ; Fermeture retardée du côté affecté par rapport au côté sain : 1 point ; Incapacité à fermer la paupière affectée : 2 points.
2. Mouvement des vibrisses (VM) :
   1. Comptez les mouvements bilatéraux des tentacules des rats en 30 s.
   2. Score selon les critères suivants : Aucune différence significative dans le mouvement bilatéral des tentacules : 0 point ; Le mouvement des moustaches du côté affecté est plus faible que celui du côté sain : 1 point ; Perte de mouvement des moustaches du côté affecté : 2 points.
3. Position de la pointe nasale.
   1. Pointe centrale du nez : 0 point ; Pointe du nez penchée vers le côté sain : 1 point.
      REMARQUE : Un score total de 0 point indique normal, 1-2 points indiquent une paralysie faciale légère (parésie), 3-4 points indiquent une paralysie faciale évidente (parésie) et 5 points indiquent une paralysie faciale complète¹⁵.

4. Détection neuroélectrophysiologique

REMARQUE : L’électrographie faciale (ENoG) a été réalisée avant la blessure, immédiatement après l’intervention chirurgicale et 48 h après l’intervention (figure 2, tableau 2, tableau 3 et tableau 4).

1. Placez l’électrode de mise à la terre sous la peau du membre inférieur gauche.
2. Insérez l’électrode d’enregistrement (électrode à aiguille concentrique bipolaire) dans le côté blessé du muscle tentaculaire, avec une profondeur de pénétration de 5 mm.
3. Placez l’électrode de stimulation (électrode à aiguille concentrique) sur la membrane du nerf facial. Stimulez séparément les extrémités proximale et distale du nerf facial blessé.
4. Utilisez un courant d’impulsion à ondes carrées avec une fréquence de 1 Hz, une largeur d’onde de 0,1 ms et une plage de filtrage de 10 à 3000 Hz.
5. Utilisez des stimuli de 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA et 20 mA pour induire la génération d’un potentiel d’action musculaire composé.
6. Enregistrez la latence (Lm) et l’amplitude de crête (Am) de l’onde M.
   REMARQUE : L’onde M fait référence à la première forme d’onde la plus évidente enregistrée. Le point où la forme d’onde quitte la ligne de base est le point de départ de la forme d’onde. La distance entre le point de départ de la ligne de base et le point de départ de la forme d’onde est Lm. La distance entre les pics les plus élevés et les plus bas de la forme d’onde est Am.
7. Prévoyez un intervalle de 5 minutes entre chaque stimulation pour assurer la récupération nerveuse.

5. Examen histologique

1. Après avoir terminé les tests électrophysiologiques, utilisez une micro-pince à épiler pour soulever le nerf et des micro-ciseaux pour couper l’échantillon nerveux. L’échantillon comprend le tronc du nerf facial du point de blessure à la glande parotide, qui est la fibre nerveuse à l’extrémité distale du point de blessure, d’une longueur totale d’environ 0,5 cm.
2. Fixer l’échantillon nerveux dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h et préparer des coupes¹⁶ incluses dans la paraffine.
3. Colorer les sections avec la méthode de coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E)¹⁶ et acquérir des images à un grossissement de 100x et 400x à l’aide d’un microscope photographique optique (Figure 3).
   REMARQUE : Après avoir retiré l’échantillon nerveux et suturé la peau sous anesthésie, les rats ont été euthanasiés par du pentobarbital sodique (150 mg/kg ; i.p.).

Résultats

Tests comportementaux
Avant l’opération, les scores du réflexe de clignement des yeux, du mouvement des palpes et de la position de la pointe nasale étaient de 0 point chez tous les rats expérimentaux, indiquant que tous les rats avaient une fonction nerveuse faciale intacte. Dans l’évaluation de la fonction du nerf facial 48 heures après l’opération, il a été constaté que les scores individuels des rats dans chaque groupe de blessures étaient augment...

Discussion

Il est nécessaire d’étudier le mécanisme de réparation des lésions du nerf facial chez les patients atteints de paralysie faciale idiopathique¹⁷. Le degré de lésion du nerf facial doit répondre aux exigences suivantes. Tout d’abord, le degré de lésion du nerf facial ne doit pas être trop léger, comme Sunderland Grade 1^st degré¹⁸, qui peut s’auto-réparer complètement sans intervention médicamenteuse. Deuxièm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS