Establecimiento de un modelo de rata con lesión del nervio facial para la investigación de la parálisis facial idiopática

Resumen

El presente protocolo establece un modelo de rata con lesión del nervio facial utilizando microscopía para investigar los mecanismos diagnósticos y terapéuticos de la parálisis facial idiopática.

Resumen

La parálisis facial idiopática es el tipo más común de lesión del nervio facial, representando aproximadamente el 70% de los casos de parálisis facial periférica. Esta enfermedad no solo puede provocar un cambio en la expresión facial, sino que también tiene un gran impacto en la psicología de los pacientes. En casos graves, puede afectar el trabajo y la vida normal de los pacientes. Por lo tanto, la investigación sobre la reparación de lesiones del nervio facial tiene una importancia clínica importante. Para estudiar el mecanismo de esta enfermedad es necesario llevar a cabo experimentos con animales relevantes, entre los cuales la tarea más importante es establecer un modelo animal con la misma patogenia que la enfermedad humana. La compresión del nervio facial dentro del hueso petroso, especialmente el tronco nervioso en la unión del extremo distal del canal auditivo interno y el segmento laberíntico, es la patogenia de la parálisis facial idiopática. Con el fin de simular esta enfermedad común, en este estudio se estableció un modelo de lesión por compresión del segmento extracraneal principal del nervio facial. El daño neurológico se evaluó mediante examen conductual, neuroelectrofisiológico e histológico. Finalmente, se seleccionaron 50 g de fuerza constante y 90 s de lesión por pinzamiento como parámetros de lesión para construir un modelo de parálisis facial idiopática estable.

Introducción

Como tipo de parálisis facial periférica, la parálisis facial idiopática es característica de etiología desconocida, inicio agudo y curso autolimitado ^1,2. La etiología y patogenia de la parálisis facial idiopática son aún inciertas³. En la actualidad, existen varios métodos de tratamiento para la parálisis facial⁴, y la diversidad de tratamientos refleja la falta de opciones de tratamiento óptimas. El uso de técnicas de biología celular y molecular para estudiar el mecanismo de la lesión del nervio facial es la base para establecer métodos de tratamiento efectivos para la parálisis facial. Por lo tanto, un modelo de lesión del nervio facial adecuado y estable es particularmente importante.

En la actualidad, no existe un método estándar para establecer un modelo de lesión del nervio facial. Los métodos de preparación actuales incluyen la inoculación del virus⁵, la transección⁶, la estimulación en frío⁷ y los métodos de compresión⁸. Se cree que la infección viral, el vasoespasmo neurotrofoblástico, la inflamación autoinmune, etc., pueden causar isquemia local, degeneración y edema del nervio facial ^9,10,11. Además, todos los factores anteriores pueden causar la compresión del tronco principal del nervio facial en el estrecho canal óseo del nervio facial^12,13. Además, las lesiones de los nervios periféricos más comunes identificadas durante los procedimientos quirúrgicos fueron la compresión y la contusión¹⁴. Basándonos en las teorías anteriores y en los fenómenos clínicos, creemos que es más razonable preparar el modelo de lesión del nervio facial a través de la lesión por compresión. Sin embargo, la mayoría de los métodos actuales para implementar lesiones por compresión no proporcionan parámetros cuantitativos de fuerza y tiempo. En este estudio, cuantificamos la fuerza y la duración de la lesión por compresión para mejorar la reproducibilidad del modelo establecido.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y supervisados por el Comité de Ética Animal del Hospital Xinhua Afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghái (XHEC-F-2023-061). Para el presente estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley, de 200-300 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 10): grupo de cirugía simulada, grupo de lesiones de 30 s, grupo de lesiones de 60 s y grupo de lesiones de 90 s.

1. Inducción de la anestesia y preparación animal

1. Use el siguiente equipo de protección personal (EPP): mascarilla quirúrgica, guantes quirúrgicos, bata desechable.
2. Pesar las ratas y anestesiarlas con clorhidrato de ketamina a una dosis de 50 mg/kg mediante inyección intraperitoneal (i.p.). Administrar meloxicam (5 mg/kg; i.p.) para la analgesia perioperatoria. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
3. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar que se sequen.
4. Después de la anestesia, coloque a las ratas en posición prona y fije la cabeza de modo que el lado izquierdo de la cara quede hacia arriba. Afeita el vello detrás de la oreja izquierda y desinfecta la piel. Cubra la rata con el paño quirúrgico estéril.

2. Establecimiento de un modelo local de lesión por aplastamiento del tronco extracraneal del nervio facial

NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo. Todas las operaciones se realizaron en el quirófano.

1. Hacer una incisión longitudinal de 2 cm de largo detrás de la oreja izquierda y diseccionar la piel y el tejido subcutáneo para separar el espacio natural entre los músculos faciales y cervicales.
2. Utilice micropinzas y microtijeras para disociar completamente el tronco del nervio facial entre el agujero estilomastoideo y la glándula parótida, con una longitud expuesta de aproximadamente 1 cm.
3. Use fórceps cuantitativos para lesiones de nervios periféricos (Tabla de materiales) para sujetar el tronco del nervio facial y causar una lesión. Localice el sitio de la lesión a 0,5 cm de distancia del agujero estilomastoideo. Aplique una intensidad de lesión de 50 g y un tiempo de lesión de 30 s, 60 s y 90 s, respectivamente.
4. Sutura la subcutánea y la piel con hilo de seda. Desinfecte la incisión.
5. En el caso de las ratas del grupo de control de cirugía simulada, se corta la piel y el tejido subcutáneo después de la anestesia y se expone y separa el tronco principal correspondiente del nervio facial. A continuación, suturó la incisión inmediatamente.
6. Vigile la salud del animal, mantenga la decúbito esternal y manténgalo en condiciones cálidas.
7. Lleva a la rata de vuelta a la jaula de alojamiento después de que la rata esté consciente.

3. Pruebas de comportamiento

NOTA: Se evaluó la función del nervio facial de las ratas antes de la cirugía y 48 h después de la cirugía (Figura 1). Se calcularon las puntuaciones del reflejo de parpadeo, el movimiento palpo y la posición de la punta nasal¹⁵. Cuanto mayor es la puntuación total, más grave es el grado de lesión del nervio facial (Tabla 1).

1. Reflejo de parpadeo (BR):
   1. Coloque una aguja de 18 g en una jeringa de 2 ml y sople aire en el ojo de la rata desde una distancia de 2 cm. Observa el movimiento y el cierre del párpado.
   2. Puntuación según los siguientes criterios: No hay diferencia significativa en ambos lados: 0 puntos; Cierre tardío del lado afectado en comparación con el lado sano: 1 punto; Incapacidad para cerrar el párpado afectado: 2 puntos.
2. Movimiento de las vibrisas (VM):
   1. Cuente los movimientos bilaterales de los tentáculos de las ratas en un plazo de 30 s.
   2. Puntuación según los siguientes criterios: No hay diferencia significativa en el movimiento bilateral de los tentáculos: 0 puntos; El movimiento de los bigotes del lado afectado es más débil que el del lado sano: 1 punto; Pérdida del movimiento de los bigotes en el lado afectado: 2 puntos.
3. Posición de la punta nasal.
   1. Punta central de la nariz: 0 puntos; Punta de la nariz inclinada hacia el lado sano: 1 punto.
      NOTA: Una puntuación total de 0 puntos indica normal, 1-2 puntos indica parálisis facial leve (paresia), 3-4 puntos indica parálisis facial evidente (paresia) y 5 puntos indica parálisis facial completa¹⁵.

4. Detección neuroelectrofisiológica

NOTA: La electrografía facial (ENoG) se realizó antes de la lesión, inmediatamente después de la cirugía y 48 h después de la cirugía (Figura 2, Tabla 2, Tabla 3 y Tabla 4).

1. Coloque el electrodo de conexión a tierra debajo de la piel de la extremidad inferior izquierda.
2. Inserte el electrodo de registro (electrodo de aguja concéntrico bipolar) en el lado lesionado del músculo tentáculo, con una profundidad de penetración de 5 mm.
3. Coloque el electrodo de estimulación (electrodo de aguja concéntrica) en la membrana del nervio facial. Estimula los extremos proximal y distal del nervio facial lesionado por separado.
4. Utilice una corriente de pulso de onda cuadrada con una frecuencia de 1 Hz, un ancho de onda de 0,1 ms y un rango de filtrado de 10-3000 Hz.
5. Utilice estímulos de 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA y 20 mA para inducir la generación de potencial de acción muscular compuesto.
6. Registre la latencia (Lm) y la amplitud máxima (Am) de la onda M.
   NOTA: La onda M se refiere a la primera y más obvia forma de onda registrada. El punto donde la forma de onda sale de la línea de base es el punto de inicio de la forma de onda. La distancia desde el punto de inicio de la línea de base hasta el punto de inicio de la forma de onda es Lm. La distancia entre los picos más altos y más bajos de la forma de onda es Am.
7. Deje un intervalo de 5 minutos entre cada estimulación para asegurar la recuperación de los nervios.

5. Examen histológico

1. Después de completar las pruebas electrofisiológicas, use micropinzas para levantar el nervio y microtijeras para cortar la muestra de nervio. El espécimen incluye el tronco del nervio facial desde el punto de lesión hasta la glándula parótida, que es la fibra nerviosa en el extremo distal del punto de lesión, con una longitud total de aproximadamente 0,5 cm.
2. Fijar la muestra de nervio en paraformaldehído al 4% durante 24 h y preparar secciones incluidas en parafina¹⁶.
3. Teñir las secciones con el método de tinción de hematoxilina-eosina (H&E)¹⁶ y obtener imágenes con aumentos de 100x y 400x utilizando un microscopio óptico fotográfico (Figura 3).
   NOTA: Después de extraer la muestra de nervio y suturar la piel bajo anestesia, las ratas fueron sacrificadas con pentobarbital sódico (150 mg/kg; i.p.).

Resultados

Pruebas de comportamiento
Antes de la cirugía, las puntuaciones del reflejo de parpadeo, el movimiento palpo y la posición de la punta nasal eran 0 puntos en todas las ratas experimentales, lo que indica que todas las ratas tenían intacta la función del nervio facial. En la evaluación de la función del nervio facial 48 h después de la cirugía, se encontró que las puntuaciones individuales de las ratas en cada grupo de lesión estaban aumentadas. Además, la p...

Discusión

Es necesario estudiar el mecanismo de reparación de la lesión del nervio facial en pacientes con parálisis facial idiopática¹⁷. El modelo de grado de lesión del nervio facial debe cumplir con los siguientes requisitos. En primer lugar, el grado de lesión del nervio facial no debe ser demasiado leve, como el Sunderland Grado^{1 grado 18}, que puede autorrepararse completamente sin intervención farmacológica. En segundo lugar,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS