הקמת מודל חולדה לפגיעה עצבית בפנים לחקר שיתוק פנים אידיופטי

Summary

הפרוטוקול הנוכחי קובע מודל חולדה של פגיעה בעצב הפנים באמצעות מיקרוסקופיה כדי לחקור את המנגנונים האבחנתיים והטיפוליים של שיתוק פנים אידיופטי

Abstract

שיתוק פנים אידיופטי הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעה בעצב הפנים, המהווה כ-70% ממקרי שיתוק הפנים ההיקפי. מחלה זו יכולה לא רק להוביל לשינוי בהבעות הפנים אלא גם להשפיע מאוד על הפסיכולוגיה של החולים. במקרים חמורים, זה יכול להשפיע על העבודה והחיים הרגילים של המטופלים. לכן, למחקר על תיקון פגיעות עצב בפנים יש משמעות קלינית חשובה. על מנת לחקור את המנגנון של מחלה זו, יש צורך לבצע ניסויים רלוונטיים בבעלי חיים, ביניהם המשימה החשובה ביותר היא להקים מודל של בעלי חיים עם אותה פתוגנזה כמו מחלות אנושיות. הדחיסה של עצב הפנים בתוך העצם הפטרוזית, במיוחד תא המטען העצבי בצומת הקצה הדיסטלי של תעלת השמע הפנימית ומקטע המבוך, היא הפתוגנזה של שיתוק פנים אידיופטי על מנת לדמות מחלה שכיחה זו, נקבע במחקר זה מודל פגיעת דחיסה של המקטע החוץ-גולגולתי העיקרי של עצב הפנים. הנזק הנוירולוגי הוערך על ידי בדיקה התנהגותית, נוירו-אלקטרופיזיולוגית והיסטולוגית. לבסוף, כוח קבוע של 50 גרם ופגיעת מהדק של 90 שניות נבחרו כפרמטרי הפציעה לבניית מודל שיתוק פנים אידיופטי יציב.

Introduction

כסוג של שיתוק פנים היקפי, שיתוק פנים אידיופטי אופייני לאטיולוגיה לא ידועה, הופעה חריפה ומהלך הגבלה עצמית ^1,2. האטיולוגיה והפתוגנזה של שיתוק פנים אידיופטי עדיין אינם ודאיים³. נכון להיום, קיימות שיטות טיפול שונות לשיתוק פנים⁴, ומגוון הטיפולים משקף את היעדר אפשרויות הטיפול האופטימליות. שימוש בטכניקות של ביולוגיה תאית ומולקולרית לחקר מנגנון הפגיעה בעצב הפנים הוא הבסיס לביסוס שיטות טיפול יעילות לשיתוק פנים. לכן, חשוב במיוחד מודל מתאים ויציב לפגיעה בעצב הפנים.

נכון לעכשיו, אין שיטה סטנדרטית להקמת מודל פגיעה בעצב הפנים. שיטות ההכנה הנוכחיות כוללות חיסון וירוסים⁵, חתך⁶, גירוי קור⁷ ודחיסה⁸. הוא האמין כי זיהום ויראלי, כלי דם נוירוטרופובלסטיים, דלקת אוטואימונית וכו', כולם עלולים לגרום לאיסכמיה מקומית, ניוון ובצקת של עצב הפנים ^9,10,11. יתר על כן, כל הגורמים לעיל יכולים לגרום לדחיסה של תא המטען הראשי של עצב הפנים בתעלת עצב הפנים הגרמית הצרה^12,13. בנוסף, הפגיעות העצביות ההיקפיות השכיחות ביותר שזוהו במהלך פרוצדורות כירורגיות היו דחיסה וחבלה¹⁴. בהתבסס על התיאוריות והתופעות הקליניות לעיל, אנו מאמינים כי הכנת מודל הפגיעה בעצב הפנים באמצעות פגיעת דחיסה היא סבירה יותר. עם זאת, רוב השיטות הנוכחיות ליישום פציעות דחיסה אינן מספקות פרמטרים כמותיים של כוח וזמן. במחקר זה, כימתנו את הכוח ומשך פגיעת הדחיסה כדי לשפר את יכולת השחזור של המודל שהוקם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו ופיקוחו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של בית החולים שינחואה המסונף לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנחאי ג'יאוטונג (XHEC-F-2023-061). חולדות זכר Sprague-Dawley, 200-300 גרם, שימשו למחקר הנוכחי. בעלי החיים הושגו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). החולדות חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות (n = 10): קבוצת ניתוח דמה, קבוצת פציעות של 30 שניות, קבוצת פציעות של 60 שניות וקבוצת פציעות של 90 שניות.

1. אינדוקציה של הרדמה והכנת בעלי חיים

1. ללבוש את ציוד המגן האישי הבא (PPE): מסכה כירורגית, כפפות כירורגיות, חלוק חד פעמי.
2. שקלו את החולדות והרדימו אותן עם קטמין הידרוכלוריד במינון של 50 מ"ג/ק"ג על ידי הזרקה תוך-צפקית (i.p). יש לתת מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג; i.p.) לשיכוך כאבים סביב הניתוח. אשר את עומק ההרדמה באמצעות צביטה בבוהן.
3. יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים למניעת יובש.
4. לאחר ההרדמה, הניחו את החולדות במצב נוטה וקבעו את הראש כך שהצד השמאלי של הפנים יהיה למעלה. לגלח את השיער מאחורי האוזן השמאלית ולחטא את העור. מכסים את החולדה בווילון הכירורגי הסטרילי.

2. קביעת מודל פגיעת ריסוק מקומי של תא המטען החוץ-גולגולתי של עצב הפנים

הערה: עקר את כל הציוד לפני השימוש. כל הניתוחים בוצעו בחדר הניתוח.

1. בצע חתך אורכי באורך 2 ס"מ מאחורי האוזן השמאלית, ונתח את העור והרקמה התת עורית כדי להפריד את הרווח הטבעי בין שרירי הפנים לצוואר הרחם.
2. השתמש בפינצטה מיקרו ובמספריים מיקרו כדי לנתק לחלוטין את תא המטען של עצב הפנים בין הנקב הסטילומסטואיד לבלוטת הפרוטיד, באורך חשוף של כ-1 ס"מ.
3. השתמש במלקחיים לפגיעה כמותית של עצב היקפי (טבלת חומרים) כדי להדק את תא המטען של עצב הפנים כדי לגרום לפציעה. אתר את מקום הפגיעה במרחק של 0.5 ס"מ מהנקב הסטילומסטואידי. החל עוצמת פציעה של 50 גרם וזמן פציעה של 30 שניות, 60 שניות ו-90 שניות, בהתאמה.
4. לתפור את העור התת עורי והעור בחוט משי. לחטא את החתך.
5. עבור חולדות בקבוצת הביקורת של ניתוחי דמה, חתכו את העור והרקמה התת עורית לאחר ההרדמה וחשפו והפרידו את הגזע הראשי המתאים של עצב הפנים. לאחר מכן, תפר את החתך מיד.
6. עקוב אחר בריאות החיה, שמור על שכיבה חזה ושמור אותה בתנאים חמים.
7. העבר את החולדה בחזרה לכלוב הדיור לאחר שהחולדה בהכרה.

3. בדיקות התנהגותיות

הערה: תפקוד עצב הפנים של החולדות הוערך לפני הניתוח ו-48 שעות לאחר הניתוח (איור 1). הציונים של רפלקס המצמוץ, תנועת המישוש ומיקום קצה האף חושבו¹⁵. ככל שהציון הכולל גבוה יותר, כך דרגת הפגיעה בעצב הפנים חמורה יותר (טבלה 1).

1. רפלקס מצמוץ (BR):
   1. חבר מחט 18 גרם למזרק של 2 מ"ל ונשף אוויר לעין החולדה ממרחק של 2 ס"מ. שימו לב לתנועת העפעפיים וסגירתם.
   2. ציון לפי הקריטריונים הבאים: אין הבדל משמעותי בשני הצדדים: 0 נקודות; סגירה מאוחרת של הצד הפגוע בהשוואה לצד הבריא: נקודה אחת; חוסר יכולת לסגור את העפעף הפגוע: 2 נקודות.
2. תנועת Vibrissae (VM):
   1. ספור את תנועות הזרוע הדו-צדדיות של חולדות תוך 30 שניות.
   2. ציון לפי הקריטריונים הבאים: אין הבדל משמעותי בתנועת זרועות דו-צדדיות: 0 נקודות; תנועת השפם של הצד הפגוע חלשה יותר מזו של הצד הבריא: נקודה אחת; אובדן תנועת שפם בצד הפגוע: 2 נקודות.
3. תנוחת קצה האף.
   1. קצה האף המרכזי: 0 נקודות; קצה האף נוטה לצד הבריא: נקודה אחת.
      הערה: ציון כולל של 0 נקודות מצביע על תקין, 1-2 נקודות מצביעות על שיתוק פנים קל (שיתוק), 3-4 נקודות מצביעות על שיתוק פנים ברור (שיתוק), ו-5 נקודות מצביעות על שיתוק פנים מלא¹⁵.

4. זיהוי נוירו-אלקטרופיזיולוגי

הערה: אלקטרוגרפיה של הפנים (ENoG) בוצעה לפני הפציעה, מיד לאחר הניתוח ו-48 שעות לאחר הניתוח (איור 2, טבלה 2, טבלה 3 וטבלה 4).

1. הנח את אלקטרודת ההארקה מתחת לעור הגפה התחתונה השמאלית.
2. הכנס את אלקטרודת ההקלטה (אלקטרודת מחט קונצנטרית דו קוטבית) לצד הפגוע של שריר המחושים, בעומק חדירה של 5 מ"מ.
3. הנח את אלקטרודת הגירוי (אלקטרודת מחט קונצנטרית) על קרום עצב הפנים. לעורר את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של עצב הפנים הפגוע בנפרד.
4. השתמש בזרם דופק גל מרובע בתדר של 1 הרץ, רוחב גל של 0.1 אלפיות השנייה וטווח סינון של 10-3000 הרץ.
5. השתמש בגירויים של 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA ו- 20 mA כדי לגרום ליצירת פוטנציאל פעולת שרירים מורכב.
6. רשום את ההשהיה (Lm) ואת משרעת השיא (Am) של גל M.
   הערה: גל M מתייחס לצורת הגל הראשונה והברורה ביותר שתועדה. הנקודה שבה צורת הגל עוזבת את קו הבסיס היא נקודת ההתחלה של צורת הגל. המרחק מנקודת ההתחלה של קו הבסיס לנקודת ההתחלה של צורת הגל הוא Lm. המרחק בין הפסגות הגבוהות והנמוכות ביותר של צורת הגל הוא Am.
7. אפשר מרווח של 5 דקות בין כל גירוי כדי להבטיח התאוששות עצבית.

5. בדיקה היסטולוגית

1. לאחר השלמת הבדיקות האלקטרופיזיולוגיות, השתמש במיקרו פינצטה כדי להרים את העצב ובמספריים מיקרו כדי לחתוך את דגימת העצב. הדגימה כוללת את תא המטען של עצב הפנים מנקודת הפגיעה ועד לבלוטת הפרוטיד, שהיא סיב העצב בקצה הדיסטלי של נקודת הפגיעה, באורך כולל של כ-0.5 ס"מ.
2. תקן את דגימת העצב ב-4% פרפורמלדהיד למשך 24 שעות והכן חלקים משובצים בפרפין¹⁶.
3. צבעו את החלקים בשיטת צביעת המטוקסילין-אאוזין (H&E)¹⁶ והשיגו תמונות בהגדלה של פי 100 ופי 400 באמצעות מיקרוסקופ צילומי אופטי (איור 3).
   הערה: לאחר הסרת דגימת העצב ותפירת העור בהרדמה, החולדות הורדמו על ידי נתרן פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג).

תוצאות

בדיקות התנהגותיות
לפני הניתוח, הציונים של רפלקס מצמוץ, תנועת מישוש ומיקום קצה האף היו 0 נקודות בכל חולדות הניסוי, מה שמצביע על כך שלכל החולדות היה תפקוד עצב פנים שלם. בהערכת תפקוד עצב הפנים 48 שעות לאחר הניתוח, נמצא כי הציונים האישיים של חולדות בכל קבוצת פציעה גד?...

Discussion

יש צורך ללמוד את מנגנון התיקון של פגיעה בעצב הפנים בחולים עם שיתוק פנים אידיופטי¹⁷. מידת הפגיעה בעצב הפנים צריכה לעמוד בדרישות הבאות. ראשית, דרגת הפגיעה בעצב הפנים לא צריכה להיות קלה מדי, כמו סנדרלנד דרגה 1^{דרגה 18}, שיכולה לתקן את עצמה לחלוטין ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS