특발성 안면마비 연구를 위한 안면신경손상 쥐 모델 구축

요약

본 프로토콜은 특발성 안면 마비의 진단 및 치료 메커니즘을 조사하기 위해 현미경을 사용하여 안면 신경 손상 쥐 모델을 확립합니다.

초록

특발성 안면 마비는 가장 흔한 유형의 안면 신경 손상으로, 말초 안면 마비 사례의 약 70%를 차지합니다. 이 질병은 얼굴 표정의 변화로 이어질 수 있을 뿐만 아니라 환자의 심리에도 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 심한 경우 환자의 정상적인 업무와 생활에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 안면 신경 손상 복구에 대한 연구는 중요한 임상적 의의를 가지고 있습니다. 이 질병의 메커니즘을 연구하기 위해서는 관련 동물 실험을 수행해야하며, 그 중 가장 중요한 과제는 인간 질병과 동일한 발병 기전을 가진 동물 모델을 확립하는 것입니다. petrous bone 내의 안면 신경, 특히 내이도의 원위 말단과 미로 분절의 교차점에 있는 신경 줄기의 압박은 특발성 안면 마비의 발병 기전입니다. 이 흔한 질병을 시뮬레이션하기 위해 이 연구에서는 안면 신경의 주요 두개외 분절에 대한 압박 손상 모델을 확립했습니다. 신경학적 손상은 행동적, 신경전기생리학적, 조직학적 검사를 통해 평가되었습니다. 마지막으로, 50g의 일정한 힘과 90초의 클램프 부상을 부상 매개변수로 선택하여 안정적인 특발성 안면 마비 모델을 구성했습니다.

서문

말초 안면 마비의 일종으로, 특발성 안면 마비는 원인을 알 수 없고, 급성 발병이 발생하며, 자기 제한적인 경과를 보이는 특징이다 ^1,2. 특발성 안면 마비의 병인과 발병기전은 아직 불확실하다³. 현재 안면마비⁴에 대한 다양한 치료법이 존재하고 있으며, 치료법의 다양성은 최적의 치료법이 부족함을 반영한다. 안면 신경 손상의 메커니즘을 연구하기 위해 세포 및 분자 생물학 기술을 사용하는 것은 안면 마비에 대한 효과적인 치료 방법을 확립하기 위한 기초입니다. 따라서 적절하고 안정적인 안면 신경 손상 모델이 특히 중요합니다.

현재로서는 안면 신경 손상 모델을 수립하기 위한 표준 방법이 없습니다. 현재 제법 방법에는 바이러스 접종⁵, 절제⁶, 냉 자극⁷ 및 압박⁸ 방법이 있습니다. 바이러스 감염, 신경영양모세포성 혈관경련, 자가면역 염증 등은 모두 안면 신경의 국소 허혈, 변성 및 부종을 유발할 수 있는 것으로 여겨진다 ^9,10,11. 더욱이, 위의 모든 요인들은 좁은 뼈 안면 신경관(narrow boney facial nerve canal)에서 안면 신경의 주요 몸통의 압박을 유발할 수 있습니다^12,13. 또한, 수술 과정에서 확인된 가장 흔한 말초 신경 손상은 압박과 타박상이었다¹⁴. 위의 이론과 임상 현상에 근거하여 압박 손상을 통해 안면 신경 손상 모델을 준비하는 것이 더 합리적이라고 생각합니다. 그러나 압박 부상을 구현하는 대부분의 현재 방법은 힘과 시간의 정량적 매개변수를 제공하지 않습니다. 이 연구에서는 확립된 모델의 재현성을 개선하기 위해 압박 손상의 힘과 지속 시간을 정량화했습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 상하이 자오퉁 의과대학 부속 신화병원 동물윤리위원회(XHEC-F-2023-061)의 승인 및 감독을 받았습니다. 본 연구에는 200-300g의 Sprague-Dawley 수컷 쥐가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조). 쥐는 무작위로 4개의 그룹(n = 10)으로 나뉘었습니다: 가짜 수술 그룹, 30대 부상 그룹, 60대 부상 그룹, 90대 부상 그룹.

1. 마취 및 동물 제제의 유도

1. 다음과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오: 수술용 마스크, 수술용 장갑, 일회용 가운.
2. 쥐의 무게를 측정하고 복강내 (IP) 주사로 50mg / kg의 용량으로 케타민 하이드로 클로라이드를 마취시킵니다. 수술 전후 진통제를 위해 meloxicam(5mg/kg, i.p.)을 투여합니다. 발가락 꼬집음을 사용하여 마취 깊이를 확인합니다.
3. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
4. 마취 후 쥐를 엎드린 자세로 놓고 얼굴 왼쪽이 위로 오도록 머리를 고정합니다. 왼쪽 귀 뒤의 털을 깎고 피부를 소독합니다. 멸균 수술용 드레이프로 쥐를 덮으십시오.

2. 안면 신경의 두개외 몸통의 국소 압착 손상 모델 구축

알림: 사용하기 전에 모든 장비를 소독하십시오. 모든 수술은 수술실에서 이루어졌습니다.

1. 왼쪽 귀 뒤쪽을 2cm 길이로 절개하여 피부와 피하 조직을 절개하여 안면 근육과 경추 근육 사이의 자연스러운 틈을 분리합니다.
2. 마이크로 핀셋과 마이크로 가위를 사용하여 약 1cm의 노출 길이로 스타일로마스토이드 구멍과 이하선 사이의 안면 신경 줄기를 완전히 해리합니다.
3. 말초 신경 정량 손상 겸자(Table of Materials)를 사용하여 안면 신경 몸통을 고정하여 부상을 유발합니다. 스타일로마스토이드 구멍에서 0.5cm 떨어진 곳에 부상 부위를 배치합니다. 부상 강도 50g과 부상 시간 각각 30초, 60초, 90초를 적용합니다.
4. 피하와 피부를 비단실로 봉합합니다. 절개 부위를 소독합니다.
5. 가짜 수술 대조군에 속한 쥐의 경우, 마취 후 피부와 피하 조직을 절개하고 해당 안면 신경의 주요 줄기를 노출시키고 분리한다. 다음으로 절개 부위를 즉시 봉합합니다.
6. 동물의 건강을 모니터링하고, 흉골 누움을 유지하고, 따뜻한 상태로 유지하십시오.
7. 쥐가 의식을 되찾은 후 쥐를 사육장으로 다시 옮기십시오.

3. 행동 테스트

참고: 쥐의 안면 신경 기능은 수술 전과 수술 후 48시간 후에 평가되었습니다(그림 1). 눈 깜빡임 반사, 손바닥 움직임, 코끝 위치의 점수는¹⁵점으로 계산되었다. 총점이 높을수록 안면 신경 손상의 정도가 더 심각합니다(표 1).

1. 점멸 반사(BR):
   1. 18mL 주사기에 2G 바늘을 부착하고 2cm 거리에서 쥐의 눈에 공기를 불어넣습니다. 눈꺼풀의 움직임과 감김을 관찰합니다.
   2. 다음 기준에 따른 점수: 양쪽에 큰 차이가 없음: 0점; 건강한 쪽과 비교하여 영향을 받은 쪽의 지연된 폐쇄: 1점; 영향을 받는 눈꺼풀을 감을 수 없음: 2점.
2. Vibrissae 움직임 (VM):
   1. 30초 이내에 쥐의 양측 촉수 움직임을 세십시오.
   2. 다음 기준에 따른 점수: 양측 촉수 움직임에 큰 차이 없음: 0점; 영향을받는 쪽의 수염의 움직임은 건강한 쪽의 움직임보다 약합니다 : 1 점; 영향을 받는 쪽의 수염 움직임 손실: 2점.
3. 코끝 위치.
   1. 중앙 노즈 팁: 0점; 코끝이 건강한 쪽으로 기울어짐: 1점.
      참고: 총점 0점은 정상, 1-2점은 경미한 안면 마비(마비), 3-4점은 명백한 안면 마비(마비), 5점은 완전한 안면 마비¹⁵를 나타냅니다.

4. 신경 전기 생리학적 검출

참고: 안면 전기 촬영(ENoG)은 부상 전, 수술 직후, 수술 후 48시간 후에 수행되었습니다(그림 2, 표 2, 표 3 및 표 4).

1. 접지 전극을 왼쪽 하지 피부 아래에 놓습니다.
2. 기록 전극(양극성 동심 바늘 전극)을 촉수 근육의 손상된 쪽에 침투 깊이를 5mm로 삽입합니다.
3. 자극 전극(동심 바늘 전극)을 안면 신경막에 놓습니다. 손상된 안면 신경의 근위부와 원위부를 개별적으로 자극합니다.
4. 주파수가 1Hz, 파폭이 0.1ms, 필터링 범위가 10-3000Hz인 구형파 펄스 전류를 사용합니다.
5. 2mA, 5mA, 10mA, 15mA, 20mA의 자극을 사용하여 복합 근육 활동 전위의 생성을 유도합니다.
6. M-파의 대기 시간(Lm)과 최대 진폭(Am)을 기록합니다.
   알림: M-wave는 기록된 첫 번째이자 가장 명백한 파형을 나타냅니다. 파형이 기준선을 벗어나는 지점이 파형의 시작점입니다. 기준선의 시작점에서 파형의 시작점까지의 거리는 Lm입니다. 파형의 가장 높은 피크와 가장 낮은 피크 사이의 거리는 Am입니다.
7. 신경 회복을 위해 각 자극 사이에 5분의 간격을 두십시오.

5. 조직학적 검사

1. 전기 생리학적 테스트를 완료한 후 마이크로 핀셋을 사용하여 신경을 들어 올리고 마이크로 가위를 사용하여 신경 표본을 절단합니다. 표본은 손상 지점에서 손상 지점의 말단에 있는 신경 섬유인 이하선까지 안면 신경 줄기를 포함하며 총 길이는 약 0.5cm입니다.
2. 신경 표본을 4% 파라포름알데히드로 24시간 동안 고정하고 파라핀 함유 절편을 준비합니다¹⁶.
3. 헤마톡실린-에오신 염색(H&E) 방법¹⁶ 으로 절편을 염색하고 광학 사진 현미경을 사용하여 100x 및 400x 배율로 이미지를 획득합니다(그림 3).
   참고: 신경 표본을 제거하고 마취 하에 피부를 봉합한 후, 쥐는 펜토바르비탈 나트륨(150mg/kg, i.p.)에 의해 안락사되었습니다.

결과

행동 테스트
수술 전 모든 실험 쥐에서 눈 깜빡임 반사, 손바닥 움직임 및 코 끝 위치의 점수는 0점이었으며, 이는 모든 쥐가 안면 신경 기능이 손상되지 않았음을 나타냅니다. 수술 48시간 후 실시한 안면 신경 기능 평가에서 각 부상 그룹에서 쥐의 개별 점수가 증가한 것으로 나타났습니다. 더욱이, 총점수는 안면 신경 손상 시간이 길어짐에 따라 점진적으?...

토론

특발성 안면 마비 환자에서 안면 신경 손상의 복구 기전을 연구할 필요가 있다¹⁷. 안면 신경 손상 정도 모델은 다음 요구 사항을 충족해야 합니다. 첫째, 안면 신경 손상의 정도는 약물 개입 없이 완전히 자가 회복할 수 있는 Sunderland Grade 1^st degree¹⁸과 같이 너무 경미해서는 안 됩니다. 둘째, 외과적 개입이 필요한 선덜랜드 5급과 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS