JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, idiyopatik fasiyal paralizinin tanı ve tedavi mekanizmalarını araştırmak için mikroskopi kullanarak bir fasiyal sinir yaralanması sıçan modeli oluşturmaktadır.

Özet

İdiyopatik fasiyal paralizi, periferik fasiyal felç vakalarının yaklaşık %70'ini oluşturan en sık fasiyal sinir yaralanması türüdür. Bu hastalık sadece yüz ifadesinde bir değişikliğe yol açmakla kalmaz, aynı zamanda hastaların psikolojisini de büyük ölçüde etkiler. Ağır vakalarda, hastaların normal çalışmasını ve yaşamını etkileyebilir. Bu nedenle, fasiyal sinir yaralanması onarımı ile ilgili araştırmalar önemli bir klinik öneme sahiptir. Bu hastalığın mekanizmasını incelemek için, en önemli görevin insan hastalığı ile aynı patogeneze sahip bir hayvan modeli oluşturmak olduğu ilgili hayvan deneylerini yapmak gerekir. İdiyopatik fasiyal paralizinin patogenezi idiyopatik fasiyal paralizinin patogenezinde, özellikle internal kulak yolunun distal ucu ile labirent segmentinin birleştiği yerde bulunan sinir gövdesi başta olmak üzere petröz kemik içinde sıkışması meydana gelir. Bu yaygın hastalığı simüle etmek için, bu çalışmada fasiyal sinirin ana ekstrakraniyal segmentinin bir kompresyon yaralanması modeli oluşturulmuştur. Nörolojik hasar davranışsal, nöroelektrofizyolojik ve histolojik muayene ile değerlendirildi. Son olarak, stabil bir idiyopatik fasiyal paralizi modeli oluşturmak için 50 g sabit kuvvet ve 90 s klemp yaralanması yaralanma parametreleri olarak seçildi.

Giriş

Periferik fasiyal paralizinin bir türü olan idiyopatik fasiyal paralizi, etiyolojisi bilinmeyen, akut başlangıçlı ve kendi kendini sınırlayan seyirli bir karakteristiktir 1,2. İdiyopatik fasiyal paralizilerin etiyolojisi ve patogenezi hala belirsizdir3. Şu anda, yüz felci4 için çeşitli tedavi yöntemleri vardır ve tedavilerin çeşitliliği, optimal tedavi seçeneklerinin eksikliğini yansıtmaktadır. Fasiyal sinir yaralanmasının mekanizmasını incelemek için hücresel ve moleküler biyoloji tekniklerini kullanmak, fasiyal felç için etkili tedavi yöntemleri oluşturmanın temelidir. Bu nedenle, uygun ve stabil bir fasiyal sinir yaralanması modeli özellikle önemlidir.

Şu anda, bir fasiyal sinir yaralanması modeli oluşturmak için standart bir yöntem yoktur. Mevcut hazırlama yöntemleri arasında virüs aşılama5, transeksiyon6, soğuk stimülasyon7 ve kompresyon8 yöntemleri bulunmaktadır. Viral enfeksiyon, nörotrofoblastik vazospazm, otoimmün inflamasyon vb.'nin hepsinin lokal iskemi, dejenerasyon ve fasiyal sinirin ödemine neden olabileceğine inanılmaktadır 9,10,11. Ayrıca, yukarıdaki faktörlerin tümü, dar kemikli fasiyal sinir kanalında fasiyal sinirin ana gövdesinin sıkışmasına neden olabilir12,13. Ek olarak, cerrahi işlemler sırasında tespit edilen en sık periferik sinir yaralanmaları kompresyon ve kontüzyondu14. Yukarıdaki teorilere ve klinik olaylara dayanarak, kompresyon yaralanması yoluyla fasiyal sinir yaralanması modelinin hazırlanmasının daha makul olduğuna inanıyoruz. Bununla birlikte, kompresyon yaralanmalarını uygulamak için mevcut yöntemlerin çoğu, kuvvet ve zamanın nicel parametrelerini sağlamamaktadır. Bu çalışmada, kurulan modelin tekrarlanabilirliğini artırmak için kompresyon yaralanmasının kuvvetini ve süresini ölçtük.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne (XHEC-F-2023-061) Bağlı Xinhua Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve denetlendi. Bu çalışma için 200-300 g ağırlığında Sprague-Dawley cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz . Sıçanlar rastgele dört gruba ayrıldı (n = 10): Sahte cerrahi grubu, 30'lu yaralanma grubu, 60'lı yaralanma grubu ve 90'lı yaralanma grubu.

1. Anestezi indüksiyonu ve hayvan hazırlığı

  1. Aşağıdaki kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) giyin: cerrahi maske, cerrahi eldiven, tek kullanımlık önlük.
  2. Sıçanları tartın ve intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile 50 mg / kg'lık bir dozda ketamin hidroklorür ile uyuşturun. Perioperatif analjezi için meloksikam (5 mg / kg; ip) uygulayın. Bir ayak parmağı tutamını kullanarak anestezi derinliğini onaylayın.
  3. Kurumayı önlemek için her iki göze de oftalmik merhem sürün.
  4. Anesteziden sonra, fareleri yüzüstü pozisyona getirin ve yüzün sol tarafı yukarı bakacak şekilde başını sabitleyin. Sol kulağın arkasındaki kılları tıraş edin ve cildi dezenfekte edin. Fareyi steril cerrahi örtü ile örtün.

2. Fasiyal sinirin ekstrakraniyal gövdesinin lokal ezilme yaralanması modelinin oluşturulması

NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanı sterilize edin. Tüm ameliyatlar ameliyathanede yapıldı.

  1. Sol kulağın arkasında 2 cm uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın ve yüz ve servikal kaslar arasındaki doğal boşluğu ayırmak için cildi ve deri altı dokusunu inceleyin.
  2. Stilomastoid foramen ile parotis bezi arasındaki fasiyal sinir gövdesini yaklaşık 1 cm açıkta kalan uzunlukta tamamen ayırmak için mikro cımbız ve mikro makas kullanın.
  3. Yaralanmaya neden olmak için fasiyal sinir gövdesini klemplemek için periferik sinir kantitatif yaralanma forsepsleri (Malzeme Tablosu) kullanın. Yaralanma bölgesini stilomastoid foramenden 0,5 cm uzağa yerleştirin. Sırasıyla 50 g yaralanma yoğunluğu ve 30 s, 60 sn ve 90 sn yaralanma süresi uygulayın.
  4. Deri altını ve cildi ipek iplikle dikin. Kesi dezenfekte edin.
  5. Sahte cerrahi kontrol grubundaki sıçanlar için, anesteziden sonra cildi ve deri altı dokusunu kesin ve fasiyal sinirin karşılık gelen ana gövdesini açığa çıkarın ve ayırın. Ardından, insizyonu hemen dikti.
  6. Hayvanın sağlığını izleyin, sternal yaslanmayı koruyun ve sıcak koşullarda tutun.
  7. Sıçan bilinçli olduktan sonra sıçanı muhafaza kafesine geri götürün.

3. Davranış testi

NOT: Sıçanların fasiyal sinir fonksiyonu ameliyattan önce ve ameliyattan 48 saat sonra değerlendirildi (Şekil 1). Göz kırpma refleksi, avuç içi hareket ve burun ucu pozisyonu skorları15 olarak hesaplandı. Toplam skor ne kadar yüksek olursa, fasiyal sinir yaralanmasının derecesi o kadar şiddetli olur (Tablo 1).

  1. Göz kırpma refleksi (BR):
    1. 2 mL'lik bir şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın ve farenin gözüne 2 cm mesafeden hava üfleyin. Göz kapağının hareketini ve kapanmasını gözlemleyin.
    2. Aşağıdaki kriterlere göre puan: Her iki taraf için de önemli bir fark yok: 0 puan; Etkilenen tarafın sağlıklı tarafa kıyasla gecikmeli kapanması: 1 puan; Etkilenen göz kapağının kapatılamaması: 2 puan.
  2. Vibrissae hareketi (VM):
    1. Sıçanların iki taraflı dokunaç hareketlerini 30 saniye içinde sayın.
    2. Aşağıdaki kriterlere göre puan: İki taraflı dokunaç hareketinde anlamlı bir fark yok: 0 puan; Etkilenen tarafın bıyıklarının hareketi sağlıklı tarafınkinden daha zayıftır: 1 puan; Etkilenen tarafta bıyık hareketi kaybı: 2 puan.
  3. Burun ucu pozisyonu.
    1. Merkez burun ucu: 0 puan; Burun ucunun sağlıklı tarafa doğru eğilmesi: 1 puan.
      NOT: Toplam 0 puan normali, 1-2 puan hafif yüz felcini (parezi), 3-4 puan belirgin yüz felcini (parezi) ve 5 puan tam yüz felcini gösterir15.

4. Nöroelektrofizyolojik algılama

NOT: Yüz elektrografisi (ENoG) yaralanmadan önce, ameliyattan hemen sonra ve ameliyattan 48 saat sonra yapıldı (Şekil 2, Tablo 2, Tablo 3 ve Tablo 4).

  1. Topraklama elektrodunu sol alt ekstremitenin derisinin altına yerleştirin.
  2. Kayıt elektrodunu (bipolar konsantrik iğne elektrodu) dokunaç kasının yaralı tarafına 5 mm penetrasyon derinliği ile yerleştirin.
  3. Stimülasyon elektrodunu (konsantrik iğne elektrodu) fasiyal sinir zarına yerleştirin. Yaralı fasiyal sinirin proksimal ve distal uçlarını ayrı ayrı uyarın.
  4. 1 Hz frekansa, 0,1 ms dalga genişliğine ve 10-3000 Hz filtreleme aralığına sahip bir kare dalga darbe akımı kullanın.
  5. Bileşik kas aksiyon potansiyelinin oluşumunu indüklemek için 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA ve 20 mA'lık uyaranlar kullanın.
  6. M dalgasının gecikmesini (Lm) ve tepe genliğini () kaydedin.
    NOT: M dalgası, kaydedilen ilk ve en belirgin dalga biçimini ifade eder. Dalga formunun taban çizgisinden ayrıldığı nokta, dalga formunun başlangıç noktasıdır. Taban çizgisinin başlangıç noktasından dalga formunun başlangıç noktasına olan mesafe Lm'dir. Dalga formunun en yüksek ve en düşük zirveleri arasındaki mesafe'dir.
  7. Sinirin iyileşmesini sağlamak için her stimülasyon arasında 5 dakikalık bir aralık bırakın.

5. Histolojik muayene

  1. Elektrofizyolojik testleri tamamladıktan sonra, siniri kaldırmak için mikro cımbız ve sinir örneğini kesmek için mikro makas kullanın. Örnek, yaralanma noktasından yaralanma noktasının distal ucundaki sinir lifi olan parotis bezine kadar olan fasiyal sinir gövdesini içerir ve toplam uzunluğu yaklaşık 0,5 cm'dir.
  2. Sinir örneğini 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve parafine gömülü bölümlerihazırlayın 16.
  3. Kesitleri hematoksilen-eozin boyama (H & E) yöntemi16 ile boyayın ve optik fotoğraf mikroskobu kullanarak 100x ve 400x büyütmede görüntüler elde edin (Şekil 3).
    NOT: Sinir örneğini çıkardıktan ve cildi anestezi altında diktikten sonra, sıçanlara pentobarbital sodyum (150 mg / kg; i.p.) ile ötenazi yapıldı.

Sonuçlar

Davranış testi
Ameliyattan önce, tüm deney sıçanlarında göz kırpma refleksi, avuç içi hareketi ve burun ucu pozisyonu skorları 0 puan idi ve bu da tüm sıçanların sağlam fasiyal sinir fonksiyonuna sahip olduğunu gösteriyordu. Ameliyattan 48 saat sonra fasiyal sinir fonksiyonu değerlendirmesinde, her yaralanma grubundaki sıçanların bireysel skorlarının arttığı bulundu. Ayrıca fasiyal sinir yaralanma süresinin uzaması ile toplam skor kademe...

Tartışmalar

İdiyopatik fasiyal paralizili hastalarda fasiyal sinir yaralanmasının onarım mekanizmasının incelenmesi gerekmektedir17. Fasiyal sinir yaralanması modelinin derecesi aşağıdaki gereksinimleri karşılamalıdır. İlk olarak, fasiyal sinir yaralanmasının derecesi, ilaç müdahalesi olmadan tamamen kendi kendini onarabilen Sunderland Grade 1st degree18 gibi çok hafif olmamalıdır. İkincisi, Sunderland 5. derece gibi c...

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82203637) ve Nanjing Tıp Üniversitesi (NMUB20210220) Bilim ve Teknoloji Geliştirme Vakfı'ndan () proje hibeleri ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehyde fixing solutionBeyotime BiotechnologyP0099
Clean bench Airtech
Electronic balance Shanghai Precision Instrument FactoryAS909
Freezing microtomeLeicaCM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kitBeyotime BiotechnologyC0105S
Ketamine Sigma57074-21-2
Optical photographic microscopeOlympusIX90
Pentobarbital sodiumChemSrc57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forcepsIn-house Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley ratsJiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscopeOPMI 1FR proergoZEISS

Referanslar

  1. Gagyor, I., Madhok, V. B., Daly, F., Sullivan, F. Antiviral treatment for Bell's palsy (idiopathic facial paralysis). Cochrane Database Syst Rev. 9 (9), (2019).
  2. Furukawa, T., et al. The use of basic fibroblast growth factor to treat intractable Bell's palsy administered via transcanal endoscopic ear surgery. Am J Otolaryngol. 45 (1), 104020 (2023).
  3. Qin, Y., et al. To explore the pathogenesis of Bell's palsy using diffusion tensor image. Sci Rep. 13 (1), 15298 (2023).
  4. Teixeira, L. J., Valbuza, J. S., Prado, G. F. Physical therapy for Bell's palsy (idiopathic facial paralysis). Cochrane Database Syst Rev. 12 (12), (2011).
  5. Mu, H., et al. The alterations and significance of intercellular adhesion molecule-1 in mouse brainstem during herpes simplex virus type 1-induced facial palsy. Appl Biochem Biotechnol. 194 (8), 3483-3493 (2022).
  6. Fujii, K., et al. Accelerated outgrowth in cross-facial nerve grafts wrapped with adipose-derived stem cell sheets. J Tissue Eng Regen Med. 14 (8), 1087-1099 (2020).
  7. Joko, T., Yamada, H., Kimura, T., Teraoka, M., Hato, N. Non-recovery animal model of severe facial paralysis induced by freezing the facial canal. Auris Nasus Larynx. 47 (5), 778-784 (2020).
  8. Cai, J., et al. Neuroprotective effect of brimonidine against facial nerve crush injury in rats via suppressing GFAP/PAF activation and neuroinflammation. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 83 (6), 449-456 (2021).
  9. Eviston, T. J., Croxson, G. R., Kennedy, P. G., Hadlock, T., Krishnan, A. V. Bell's palsy: aetiology, clinical features and multidisciplinary care. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 86 (12), 1356-1361 (2015).
  10. Heckmann, J. G., Urban, P. P., Pitz, S., Guntinas-Lichius, O., Gagyor, I. The diagnosis and treatment of idiopathic facial paresis (Bell's Palsy). Dtsch Arztebl Int. 116 (41), 692-702 (2019).
  11. Zhang, W., et al. The etiology of Bell's palsy: a review. J Neurol. 267 (7), 1896-1905 (2020).
  12. Touska, P., et al. Computed tomographic features of the proximal petrous facial nerve canal in recurrent Bell's palsy. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 6 (4), 816-823 (2021).
  13. Murai, A., et al. The facial nerve canal in patients with Bell's palsy: an investigation by high-resolution computed tomography with multiplanar reconstruction. Eur Arch Otorhinolaryngol. 270 (7), 2035-2038 (2013).
  14. Mourad, S. I., Al-Dubai, S. A., Elsayed, S. A., El-Zehary, R. R. Efficacy of platelet-rich fibrin and tacrolimus on facial nerve regeneration: an animal study. Int J Oral Maxillofac Surg. 51 (2), 279-287 (2022).
  15. Chen, D., Zhang, D., Xu, L., Han, Y., Wang, H. The alterations of matrix metalloproteinase-9 in mouse brainstem during herpes simplex virus type 1-induced facial palsy. J Mol Neurosci. 51 (3), 703-709 (2013).
  16. Hu, B., et al. Delivery of basic fibroblast growth factor through an in situ forming smart hydrogel activates autophagy in Schwann cells and improves facial nerves generation via the PAK-1 signaling pathway. Front Pharmacol. 13, 778680 (2022).
  17. Kline, L. B., Kates, M. M., Tavakoli, M. Bell Palsy. JAMA. 326 (19), 1983 (2021).
  18. Kamble, N., Shukla, D., Bhat, D. Peripheral nerve injuries: Electrophysiology for the neurosurgeon. Neurol India. 67 (6), 1419-1422 (2019).
  19. Machetanz, K., et al. Design and evaluation of a custom-made electromyographic biofeedback system for facial rehabilitation. Front Neurosci. 16, 666173 (2022).
  20. Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease. Nat Rev Neurosci. 15 (6), 394-409 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Fasiyal Sinir Yaralanmasdiyopatik Fasiyal ParaliziHayvan ModeliPeriferik Fasiyal ParaliziN rolojik HasarBaset YaralanmasPatogenezDavran sal MuayeneN roelektrofizyolojik De erlendirmeHistolojik nceleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır