Etablierung eines Modells für die Forschung zur idiopathischen Gesichtslähmung

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll etabliert ein Modell der Gesichtsnervenverletzung bei der Ratte mit Hilfe der Mikroskopie, um die diagnostischen und therapeutischen Mechanismen der idiopathischen Gesichtslähmung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die idiopathische Gesichtslähmung ist die häufigste Art der Gesichtsnervenverletzung und macht etwa 70 % der Fälle von peripherer Gesichtslähmung aus. Diese Krankheit kann nicht nur zu einer Veränderung des Gesichtsausdrucks führen, sondern auch die Psychologie der Patienten stark beeinflussen. In schweren Fällen kann es die normale Arbeit und das Leben der Patienten beeinträchtigen. Daher ist die Forschung zur Reparatur von Gesichtsnervenverletzungen von großer klinischer Bedeutung. Um den Mechanismus dieser Krankheit zu untersuchen, ist es notwendig, entsprechende Tierversuche durchzuführen, von denen die wichtigste Aufgabe darin besteht, ein Tiermodell mit der gleichen Pathogenese wie die menschliche Krankheit zu etablieren. Die Kompression des Nervus facialis innerhalb des Felsenbeins, insbesondere des Nervenstamms an der Verbindung des distalen Endes des Gehörgangs internus mit dem labyrinthischen Segment, ist die Pathogenese der idiopathischen Gesichtslähmung. Um diese häufige Erkrankung zu simulieren, wurde in dieser Studie ein Kompressionsverletzungsmodell des extrakraniellen Hauptsegments des Nervus facialis etabliert. Die neurologische Schädigung wurde durch verhaltensbezogene, neuroelektrophysiologische und histologische Untersuchungen beurteilt. Schließlich wurden 50 g konstante Kraft und 90 s Klemmverletzung als Verletzungsparameter ausgewählt, um ein stabiles idiopathisches Gesichtslähmungsmodell zu konstruieren.

Einleitung

Die idiopathische Gesichtslähmung ist als eine Form der peripheren Gesichtslähmung charakteristisch für unbekannte Ätiologie, akuten Beginn und selbstlimitierenden Verlauf ^1,2. Die Ätiologie und Pathogenese der idiopathischen Gesichtslähmung ist noch unklar³. Derzeit gibt es verschiedene Behandlungsmethoden für die Gesichtslähmung⁴, und die Vielfalt der Behandlungen spiegelt den Mangel an optimalen Behandlungsmöglichkeiten wider. Der Einsatz zellular- und molekularbiologischer Techniken zur Untersuchung des Mechanismus der Gesichtsnervenverletzung ist die Grundlage für die Etablierung wirksamer Behandlungsmethoden für Gesichtslähmungen. Daher ist ein geeignetes und stabiles Modell der Gesichtsnervenverletzung besonders wichtig.

Derzeit gibt es keine Standardmethode für die Etablierung eines Modells für Gesichtsnervenverletzungen. Zu den aktuellen Präparationsmethoden gehören die Virusimpfung⁵, die Durchtrennung⁶, die Kältestimulation⁷ und die Kompressionsmethode⁸. Es wird angenommen, dass eine Virusinfektion, ein neurotrophoblastischer Vasospasmus, eine Autoimmunentzündung usw. lokale Ischämie, Degeneration und Ödeme des Gesichtsnervs verursachen können ^9,10,11. Darüber hinaus können alle oben genannten Faktoren eine Kompression des Hauptstamms des Nervus facialis in dem engen knöchernen Gesichtsnervenkanal verursachen^12,13. Darüber hinaus waren die häufigsten peripheren Nervenverletzungen, die bei chirurgischen Eingriffen festgestellt wurden, Kompression und Prellung¹⁴. Basierend auf den oben genannten Theorien und klinischen Phänomenen glauben wir, dass die Vorbereitung des Modells der Gesichtsnervenverletzung durch Kompressionsverletzung vernünftiger ist. Die meisten der derzeitigen Methoden zur Durchführung von Kompressionsverletzungen liefern jedoch keine quantitativen Parameter für Kraft und Zeit. In dieser Studie haben wir die Kraft und Dauer der Kompressionsverletzung quantifiziert, um die Reproduzierbarkeit des etablierten Modells zu verbessern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission des Xinhua-Krankenhauses, das der Shanghai Jiaotong University School of Medicine angegliedert ist, genehmigt und überwacht (XHEC-F-2023-061). Für die vorliegende Studie wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten, 200-300 g, verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). Die Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen (n = 10) eingeteilt: Scheinchirurgie-Gruppe, 30-s-Verletzungsgruppe, 60-s-Verletzungsgruppe und 90-s-Verletzungsgruppe.

1. Einleitung der Anästhesie und Vorbereitung der Tiere

1. Tragen Sie die folgende persönliche Schutzausrüstung (PSA): OP-Maske, OP-Handschuhe, Einwegkittel.
2. Wiegen Sie die Ratten und betäuben Sie sie mit Ketaminhydrochlorid in einer Dosis von 50 mg/kg durch intraperitoneale (i.p.) Injektion. Meloxicam (5 mg/kg; i.p.) zur perioperativen Analgesie verabreichen. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenkneifen.
3. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
4. Bringen Sie die Ratten nach der Anästhesie in die Bauchlage und fixieren Sie den Kopf so, dass die linke Gesichtshälfte nach oben zeigt. Rasieren Sie die Haare hinter dem linken Ohr ab und desinfizieren Sie die Haut. Decken Sie die Ratte mit dem sterilen OP-Tuch ab.

2. Etablierung eines lokalen Quetschverletzungsmodells des extrakraniellen Rumpfes des Nervus facialis

HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Geräte vor dem Gebrauch. Alle Operationen wurden im Operationssaal durchgeführt.

1. Machen Sie einen 2 cm langen Längsschnitt hinter dem linken Ohr und präparieren Sie die Haut und das Unterhautgewebe, um den natürlichen Spalt zwischen Gesichts- und Halsmuskulatur zu trennen.
2. Verwenden Sie eine Mikropinzette und eine Mikroschere, um den Stamm des Gesichtsnervs zwischen dem Foramen stylomastoideus und der Ohrspeicheldrüse mit einer freiliegenden Länge von ca. 1 cm vollständig zu dissoziieren.
3. Verwenden Sie eine quantitative Verletzungszange des peripheren Nerven (Materialtabelle), um den Stamm des Gesichtsnervs zu klemmen, um eine Verletzung zu verursachen. Lokalisieren Sie die Verletzungsstelle 0,5 cm vom Foramen stylomastoideus. Wenden Sie eine Verletzungsintensität von 50 g und eine Verletzungszeit von 30 s, 60 s bzw. 90 s an.
4. Nähen Sie die Unterhaut und die Haut mit Seidenfaden. Desinfizieren Sie den Schnitt.
5. Bei Ratten in der scheinchirurgischen Kontrollgruppe schneiden Sie nach der Anästhesie die Haut und das Unterhautgewebe und legen den entsprechenden Hauptstamm des Gesichtsnervs frei und trennen ihn. Als nächstes nähten Sie den Schnitt sofort.
6. Überwachen Sie die Gesundheit des Tieres, halten Sie das Brustbein liegend und halten Sie es unter warmen Bedingungen.
7. Bringen Sie die Ratte zurück in den Käfig, nachdem die Ratte bei Bewusstsein ist.

3. Verhaltenstests

HINWEIS: Die Funktion des Gesichtsnervs der Ratten wurde vor der Operation und 48 Stunden nach der Operation untersucht (Abbildung 1). Die Werte für den Blinzelreflex, die Palpbewegung und die Position der Nasenspitze wurden berechnet¹⁵. Je höher die Gesamtpunktzahl, desto schwerer ist der Grad der Gesichtsnervenverletzung (Tabelle 1).

1. Blinzelreflex (BR):
   1. Befestigen Sie eine 18-G-Nadel an einer 2-ml-Spritze und blasen Sie aus einer Entfernung von 2 cm Luft in das Auge der Ratte. Beobachten Sie die Bewegung und den Verschluss der Augenlider.
   2. Punktzahl nach folgenden Kriterien: Kein signifikanter Unterschied auf beiden Seiten: 0 Punkte; Verzögerter Verschluss der betroffenen Seite im Vergleich zur gesunden Seite: 1 Punkt; Unfähigkeit, das betroffene Augenlid zu schließen: 2 Punkte.
2. Vibrissae Bewegung (VM):
   1. Zählen Sie die beidseitigen Tentakelbewegungen von Ratten innerhalb von 30 s.
   2. Punktzahl nach folgenden Kriterien: Kein signifikanter Unterschied in der bilateralen Tentakelbewegung: 0 Punkte; Die Bewegung der Schnurrhaare der betroffenen Seite ist schwächer als die der gesunden Seite: 1 Punkt; Verlust der Schnurrhaarbewegung auf der betroffenen Seite: 2 Punkte.
3. Position der Nasenspitze.
   1. Nasenspitze in der Mitte: 0 Punkte; Nasenspitze zur gesunden Seite geneigt: 1 Punkt.
      HINWEIS: Eine Gesamtpunktzahl von 0 Punkten bedeutet normal, 1-2 Punkte weisen auf eine leichte Gesichtslähmung (Parese) hin, 3-4 Punkte auf eine offensichtliche Gesichtslähmung (Parese) und 5 Punkte auf eine vollständige Gesichtslähmung¹⁵.

4. Neuroelektrophysiologische Detektion

HINWEIS: Die Gesichtselektrographie (ENoG) wurde vor der Verletzung, unmittelbar nach der Operation und 48 Stunden nach der Operation durchgeführt (Abbildung 2, Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4).

1. Platzieren Sie die Erdungselektrode unter der Haut der linken unteren Extremität.
2. Führen Sie die Aufzeichnungselektrode (bipolare konzentrische Nadelelektrode) mit einer Eindringtiefe von 5 mm in die verletzte Seite des Tentakelmuskels ein.
3. Platzieren Sie die Stimulationselektrode (konzentrische Nadelelektrode) auf der Gesichtsnervenmembran. Stimulieren Sie die proximalen und distalen Enden des verletzten Gesichtsnervs getrennt.
4. Verwenden Sie einen Rechteckimpulsstrom mit einer Frequenz von 1 Hz, einer Wellenbreite von 0,1 ms und einem Filterbereich von 10-3000 Hz.
5. Verwenden Sie Stimuli von 2 mA, 5 mA, 10 mA, 15 mA und 20 mA, um die Erzeugung eines zusammengesetzten Muskelaktionspotentials zu induzieren.
6. Zeichnen Sie die Latenz (Lm) und die Spitzenamplitude (Am) der M-Welle auf.
   HINWEIS: Die M-Welle bezieht sich auf die erste und offensichtlichste aufgezeichnete Wellenform. Der Punkt, an dem die Wellenform die Grundlinie verlässt, ist der Startpunkt der Wellenform. Der Abstand vom Startpunkt der Basislinie zum Startpunkt der Wellenform beträgt Lm. Der Abstand zwischen der höchsten und der niedrigsten Spitze der Wellenform ist Am.
7. Lassen Sie zwischen den einzelnen Stimulationen ein Intervall von 5 Minuten ein, um die Erholung der Nerven zu gewährleisten.

5. Histologische Untersuchung

1. Verwenden Sie nach Abschluss der elektrophysiologischen Tests eine Mikropinzette, um den Nerv anzuheben, und eine Mikroschere, um die Nervenprobe zu schneiden. Die Probe umfasst den Stamm des Nervus facialis von der Verletzungsstelle bis zur Ohrspeicheldrüse, die die Nervenfaser am distalen Ende der Verletzungsstelle darstellt, mit einer Gesamtlänge von etwa 0,5 cm.
2. Die Nervenprobe wird 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert und die in Paraffin eingebetteten Schnitte^{vorbereitet 16}.
3. Die Schnitte werden mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbemethode (H&E)¹⁶ gefärbt und mit einem optischen Fotomikroskop Bilder bei 100- und 400-facher Vergrößerung aufgenommen (Abbildung 3).
   HINWEIS: Nach der Entnahme der Nervenprobe und dem Nähen der Haut unter Narkose wurden die Ratten mit Pentobarbital-Natrium (150 mg/kg; i.p.) euthanasiert.

Ergebnisse

Verhaltenstests
Vor der Operation betrugen die Werte für den Blinzelreflex, die Palpbewegung und die Position der Nasenspitze bei allen Versuchsratten 0 Punkte, was darauf hindeutet, dass alle Ratten eine intakte Funktion des Gesichtsnervs hatten. Bei der Beurteilung der Funktion des Gesichtsnervs 48 h nach der Operation wurde festgestellt, dass die individuellen Werte der Ratten in jeder Verletzungsgruppe erhöht waren. Darüber hinaus stieg die Gesamtpunktzahl mit ...

Diskussion

Es ist notwendig, den Reparaturmechanismus der Gesichtsnervenverletzung bei Patienten mit idiopathischer Gesichtslähmung zu untersuchen¹⁷. Das Modell für den Grad der Gesichtsnervenverletzung sollte die folgenden Anforderungen erfüllen. Erstens sollte der Grad der Gesichtsnervenverletzung nicht zu mild sein, wie z. B. Sunderland Grad 1^st Grad¹⁸, der sich ohne medikamentöse Intervention vollständig selbst reparieren kann. Zwe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde fixing solution	Beyotime Biotechnology	P0099
Clean bench	Airtech
Electronic balance	Shanghai Precision Instrument Factory	AS909
Freezing microtome	Leica	CM1900
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime Biotechnology	C0105S
Ketamine	Sigma	57074-21-2
Optical photographic microscope	Olympus	IX90
Pentobarbital sodium	ChemSrc	57-33-0
Quantitative peripheral nerve injury forceps	In-house		Patent number: CN20082015530.3
Sprague-Dawley rats	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Surgical operating microscope	OPMI 1FR proergo	ZEISS