التحقق الأولي من إحداثيات الحقن التجسيمي عن طريق التقسيم بالتبريد

Summary

يصف هذا البروتوكول استراتيجية عملية للتعجيل بخطوة التحقق من إحداثيات الحقن التجسيمي قبل إجراء تتبع الفيروس باستخدام الأصباغ والأقسام المجمدة.

Abstract

يشكل الحقن التجسيمي لمنطقة معينة من الدماغ تقنية تجريبية أساسية في علم الأعصاب الأساسي. عادة ما يبني الباحثون اختيارهم لمعلمات الحقن التجسيمي على أطالس دماغ الفئران أو المواد المنشورة التي تستخدم مجموعات / أعمار مختلفة من الفئران ومعدات تجسيمية مختلفة ، مما يستلزم مزيدا من التحقق من صحة معلمات الإحداثيات المجسمة. تعتمد فعالية تصوير الكالسيوم والتلاعب الكيميائي الوراثي والبصري الوراثي على التعبير الدقيق لجينات المراسل داخل المنطقة محل الاهتمام ، وغالبا ما تتطلب عدة أسابيع من الجهد. وبالتالي ، فهي مهمة تستغرق وقتا طويلا إذا لم يتم التحقق من إحداثيات منطقة الدماغ المستهدفة مسبقا. باستخدام صبغة مناسبة بدلا من الفيروس وتنفيذ التقسيم بالتبريد ، يمكن للباحثين مراقبة موقع الحقن مباشرة بعد إعطاء الصبغة. هذا يسهل التعديلات في الوقت المناسب لتنسيق المعلمات في الحالات التي توجد فيها تناقضات بين موقع الحقن الفعلي والموضع النظري. هذه التعديلات تعزز بشكل كبير دقة التعبير الفيروسي داخل المنطقة المستهدفة في التجارب اللاحقة.

Introduction

تتطلب جميع أدوات التعديل العصبي الحديثة تقريبا ، بما في ذلك تسجيل الكالسيوم في الجسم الحي ، والأدوات البصرية الوراثية ، والأدوات الكيميائية الجينية ، استخدام إحداثيات مجسمة لاستهداف منطقة الدماغ محل الاهتمام^1،2،3 ، مما يشكل أساس التلاعب العصبي. يتم تعريف الإحداثيات المجسمة لمناطق دماغ الفأر فيما يتعلق ب bregma و lambda ، المعالم العظمية على الجمجمة ، والتي تشكل ما يسمى بنظام الإحداثيات التجسيمية المشتقة من الجمجمة. يمكن أن يكون البريغما أو لامدا بمثابة نقطة الصفر للإحداثيات ثلاثية الأبعاد. المحاور الثلاثة هي الأمامية الخلفية (AP) ، والمتوسطة الجانبية (ML) ، والظهرية البطنية (DV) ، والتي تمثل المحاور y و x و z على الشاشة الرقمية للأدوات المجسمة. بالنسبة لمناطق الدماغ المعروفة ، يمكن الحصول على معلمات الإحداثيات المجسمة لمنطقة معينة من أطالس دماغ الفأر⁴ (على سبيل المثال ، Paxinos ودماغ فأر فرانكلين في الإحداثيات المجسمة) و / أو الأدبيات المنشورة ^5,6. ومع ذلك ، من الضروري إجراء مزيد من التحقق بسبب الاختلافات في معدات التجسيم وعمر / أعداد الفئران المستخدمة من قبل باحثين مختلفين.

الهيكل هو أساس الوظيفة. تشكل الدوائر العصبية الأساس للعديد من وظائف الدماغ ، مثل الأنشطة المعرفية والعاطفة والذاكرة والوظائف الحسية والحركية¹. يعد وضع العلامات على البنية والتلاعب بنشاط الدوائر العصبية أمرا حيويا لفهم وظيفة دائرة عصبية معينة. على مدى العقود الماضية ، تطورت المتتبعات العصبية عبر أجيال عديدة. اعتمدت الأبحاث المبكرة أغلوتينين جنين القمح (WGA) و phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) كمتتبعات تقدمية ، والفلوروغولد (FG) ، الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (CTB) ، الكاربوسيانين كمتتبعات رجعية. ومع ذلك ، على عكس المتتبعات الفيروسية ، لا يمكن لهذه المقتفيات العصبية التقليدية دمج الجينات الخارجية في المضيف ، ولا تتمتع بانتقائية نوع الخلية. في الوقت الحاضر ، أصبحت الاستراتيجية الفيروسية اقتراحا مهما خلال أبحاث علم الأعصاب الأساسية. لأغراض بحثية مختلفة ، يمكن اختيار أدوات فيروسية مختلفة ^7,8. هناك فيروسات غير عبر المشبكي ، وفيروسات عبر متعدد المشابك (رجعية وتقدمية) ، وفيروسات عبر أحادي المشبك (رجعي وأمامي). تحتوي كل فئة على عدة أنواع لها خصائص كل منها.

تستغرق عملية الإعطاء والتعبير الفيروسي وقتا طويلا وموارد كثيفة الاستخدام ، وغالبا ما تستغرق أسابيع أو حتى أكثر. من بين النواقل الفيروسية المختلفة ، تم تحديد الفيروس المرتبط بالغدي كوسيلة واعدة لتوصيل الجينات ، مما يوفر نافذة واسعة تتراوح من 3 إلى 8 أسابيع بعد الحقن للإجراء التجريبي ^7,8. مع تطور AAV ، يمكن إجراء التحليل بعد 2-3 أسابيع من إعطاء ^9,10. تتطلب متتبعات الدوائر العصبية الأخرى ، مثل فيروس داء الكاذب (PRV) وفيروس داء (RV) ، فترة تتبع لا تقل عن 2-7 أيام^{11،12،13،14،15}. وبالتالي ، فإن التحقق الأولي من موقع الحقن قبل مراقبة إشارات التألق يكون فعالا من حيث الوقت والتكلفة.

لتسهيل التحقق البسيط والسريع من الحقن التجسيمية ، في هذه الدراسة ، يتم إعطاء صبغة قبل النواقل الفيروسية ، ويمكن التشريح بالتبريد الباحثين من مراقبة موقع الحقن وتتبعه في غضون 30 دقيقة بعد الحقن.

Protocol

أجريت جميع التجارب على وفقا لإرشادات الإبلاغ عن البحوث الحيوانية في التجارب الحية (ARRIVE) ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. تمت الموافقة على الدراسة الحالية من قبل لجنة رعاية واستخدام في مستشفى رينجي ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياوتونغ. تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J البالغة من العمر ثمانية أسابيع في الدراسة الحالية. تم الحصول على تجاريا (انظر جدول المواد) وتم وضعها في أقفاص قياسية (22 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ، 12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام ، الطعام ، والماء حسب الرغبة).

1. اختيار مناطق الدماغ المستهدفة

ملاحظة: هذا إجراء معقم. تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية. رش القفازات بالكحول قبل ملامسة الأدوات الجراحية. تجنب لمس طرف الأدوات أو المنطقة الجراحية بالقفازات. تأكد من تخدير الفأر بشكل كاف قبل بدء الإجراء عن طريق التحقق من فقدان ردود الفعل الصحيحة وعدم الاستجابة للتحفيز الجلدي. قبل الحفر والحقن ، راقب عن كثب معدل التنفس (60-220 نفسا في الدقيقة ، بمتوسط 100-150 نفسا في الدقيقة) وسعة التنفس (يجب أن تكون متسقة وليست ضحلة أو عميقة بشكل مفرط). يجب ملاحظة أي تغييرات كبيرة في معدل التنفس أو السعة.

1. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق بنسبة 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول (250 ملغم / كغم) باستخدام إبرة 29 غرام. حلق الشعر على الجمجمة بمجرد اختفاء رد الفعل الصحيح. قم بتأمين الماوس في الإطار التجسيمي (انظر جدول المواد) عن طريق تثبيت القواطع العلوية بمشبك أنف وتثبيت الرأس باستخدام قضيبين للأذن.
2. تطبيق مرهم العيون لمنع جفاف العين. تطهير فروة الرأس عن طريق مسحها ثلاث مرات مع Anerdian (محلول مطهر ؛ انظر جدول المواد). حقن 0.2 مل من 1٪ ليدوكائين تحت الجلد باستخدام إبرة الأنسولين 29 غرام لتوفير تسكين موضعي.
3. قم بعمل شق 0.5 سم باستخدام مقص العين لكشف الجمجمة. استخدم قطعة قطن مغموسة بنسبة 3٪ H₂O₂ لفرك الجمجمة المكشوفة لإزالة السمحاق. اترك الجمجمة حتى تجف.
4. لصق الحفر على أداة stereotaxic. اضبط مقابض الأذرع المجسمة لوضع طرف الحفر بدقة في bregma بمساعدة المكبر وتسجيل قيمة المحور z باستخدام شاشة LCD الرقمية.
   1. اضبط المقابض وضع طرف الحفر في لامدا وسجل قيمة المحور z. اضبط مشبك الأنف وقضبان الأذن لتقريب قيمتي z ، وكرر الخطوات أعلاه حتى يصبح الفرق بين قيمتي z أقل من 0.1 مم.
      ملاحظة: تتوافق المحاور x و y و z على شاشة LCD الرقمية مع المحاور المتوسطة (ML) والأمامية الخلفية (AP) والظهرية البطنية (DV) على التوالي. يمكن اعتبار bregma و lambda على نفس المستوى الأفقي بمجرد أن يكون الفرق بين قيمتي z أقل من 0.1 مم.
5. ضمان مستوى اليسار واليمين من الدماغ. اضبط قضبان الأذن المرفقة بالإطار التجسيمي بنفس المقياس. خذ النواة الرباعية اللاحقة ، الجزء البطني (LDTgV) ، على سبيل المثال ؛ إحداثياتها المجسمة هي -5.2 ل x ، +0.8 ل y ، -4.0 ل z ، وفقا ل Paxinos و Franklin's Mouse Brain^{Atlas 16}.
   1. اضبط شريط الأذن لعمل المثقاب عند (-5.2 ، +0.8) لقياس قيمة z في الاتجاه الظهري البطني وحرك المثقاب إلى (-5.2 ، -0.8) لقياس قيمة z.
      ملاحظة: يعتبر اليسار-اليمين عند المستوى المتساوي عندما يكون الفرق بين قيمتي z أقل من 0.2 مم. يجب إدخال قضبان الأذن في المكان المناسب لأن الصماخ السمعي الخارجي متماثل. إذا كان الفرق بين قيمتي z أكثر من 0.5 مم ، فقد يتم إدخال شريط الأذن في المكان الخطأ.
6. ضع المثقاب على bregma مرة أخرى واضبط ثلاثة إحداثيات على شاشة LCD الرقمية على الصفر. ضع التمرين فوق منطقة الاهتمام باستخدام الإحداثيات المرجعية. ابدأ التدريبات.
   1. خفض تدريجيا الحفر باستخدام الذراع العمودي حتى يخترق الجمجمة. قم بإزالة الحطام والدم باستخدام مسحات القطن.
      ملاحظة: احرص على عدم إتلاف أنسجة المخ.

2. تحضير محلول الصبغة والحقن المجهري للدماغ

1. خذ 25 ميكرولتر من مخزن التحميل SDS-PAGE الذي يحتوي على بروموفينول أزرق (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 ميكرولتر. أضف 50 ميكرولتر من ddH₂O إلى الأنبوب لتحضير محلول الصبغة.
2. قم بتغطية نافذة الجمجمة بقطعة قطن مبللة بالمحلول الملحي. تأكد من سالكية الحقن الدقيقة عن طريق شفط وطرد المحلول الملحي بشكل متكرر. قم بتحميل 0.3 ميكرولتر من الصبغة في المحقنة الدقيقة. قم بتوصيل المحقنة والحاقن الدقيق التجسيمي الميكانيكي بالذراع المجسم.
3. ضع طرف المحقنة في bregma واضبط الإحداثيات على الصفر على شاشة LCD الرقمية. اضبط الإبرة في منطقة الاهتمام وفقا للإحداثيات المرجعية. اضبط سرعة الحقن على 0.1 ميكرولتر / دقيقة وابدأ الحاقن الدقيق الميكانيكي ، مما يوفر 0.3 ميكرولتر من الصبغة الزرقاء في المنطقة المستهدفة. اترك المحقنة في موضعها لمدة 10 دقائق على الأقل قبل سحب الحاقن ببطء.
   ملاحظة: يمكن استخدام أصباغ ملونة مختلفة في نفس الفئران لتمييز المناطق القريبة. اختبر الأصباغ الأخرى بحثا عن تركيزات مناسبة بناء على خصائصها الفيزيائية. يوصى باستخدام تركيبة البروموفينول الأزرق وشطف المحقنة جيدا قبل الاستخدام وبعده لمنع الانسداد. اضبط أحجام الحقن بناء على انتشار الصبغة.

3. حصاد أنسجة المخ والتشريح بالتبريد

1. حرر الماوس من الإطار المجسم. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من 50 ملغم / كغم من الصوديوم بنتوباربيتال باستخدام إبرة 29 غرام. تأمين الماوس على لوحة رغوة مع الشريط.
2. افتح جانبي الصدر للحث على الاختناق السريع. قم بعمل شق 1-2 مم في الزائدة الأذينية اليمنى. أدخل إبرة التسريب في البطين الأيسر. تنقع 20 مل من محلول ملحي مبرد مسبقا و 20 مل من محلول بارافورمالدهايد المثلج 4٪.
3. قطع رأس الفأر بمقص تشريح الأنسجة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). قم بإزالة الجلد عن طريق إجراء شق على طول خط الوسط من الرقبة إلى الأنف ثم كشف الجمجمة. تخلص من العضلات المتبقية على الجمجمة بالملقط أو المقص.
4. ضع طرف شفرة واحدة من المقص الناعم بين الثقبة العظمى والدماغ ، مع الحافة الحادة التي تواجه العظم ، في نهاية المنضدة من الخيط السهمي الأوسط. المضي قدما في الانزلاق وقطع الجمجمة على طول خياطة منتصف السهمي. استخدم ملقط لإزالة الجمجمة ، وكشف الدماغ المكشوف.
   ملاحظة: توخي الحذر لتجنب التسبب في أي ضرر للدماغ أثناء العملية. قبل إزالة رقائق العظام ، انزع بعناية أي سحايا قد تكون متصلة بالجمجمة. هذا الاحتياط ضروري لمنع التقطيع غير المقصود لأنسجة المخ أثناء العملية.
5. قم بتشغيل قوة كريوستات الميكروتوم الدوار (انظر جدول المواد) واضبط درجة حرارة الغرفة على -20 درجة مئوية. صب القليل من مركب OCT لتغطية سطح قرص العينة بالتساوي. ضعه في غرفة التبريد واسمح ل OCT بالتصلب.
6. قم بتوصيل القرص برأس العينة. اجعل الشفرة أقرب إلى الكتلة وقم بقص كتلة OCT لعمل مستوى مسطح مواز للقرص.
7. قطع الدماغ في اتجاه إكليلي بعيدا عن موقع الحقن في قالب شريحة الدماغ بواسطة شفرة حلاقة. ضع أنسجة المخ التي تحتوي على موقع الحقن مع الجانب المقطوع لأسفل على المستوى المسطح OCT.
   1. صب OCT على الدماغ ووضع القرص في غرفة التبريد ، مما يسمح لكتلة العينة بالتصلب. صب OCT بشكل متكرر على الدماغ حتى يتم دمج الدماغ بالكامل مع OCT.
      ملاحظة: أضف مركب OCT طبقة تلو الأخرى. بمجرد تجميد الطبقة السابقة من OCT ، صب الطبقة اللاحقة من مركب OCT على الدماغ.
8. قم بقص كتلة العينة حتى تقترب المنطقة المستهدفة. اصنع عدة أقسام من مستوى موقع الحقن. اجمع شرائح الدماغ الإكليلي في طبق من 6 آبار يحتوي على برنامج تلفزيوني بدرجة حرارة الغرفة باستخدام فرشاة كتابة صغيرة محفوظة عند -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: اضبط سمك القطع على سمك أكبر لتقليم الكتلة ، ثم اضبط سمك القطع على 40 ميكرومتر عندما تقترب الشفرة من موقع الحقن. إذا تم استخدام متتبعات الدوائر العصبية ، فلن يتم التضحية بالفئران على الفور. ضع الماوس في قفص تعافي معقم بعد العملية الجراحية فوق بطانية تدفئة للتعافي من التخدير. أعد الفئران إلى القفص الأصلي أو قفص جديد بمجرد استيقاظها.

4. التصوير

1. اغسل OCT بدرجة حرارة الغرفة PBS. استخدم فرشاة لالتقاط أقسام الدماغ ووضعها على شريحة. اترك الأقسام تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة.
2. راقب المنطقة المحقونة بصريا أو استخدم المجهر عندما تكون النوى المستهدفة ضئيلة. قارن موقع الصبغة المحقونة بالمنطقة المقابلة في أطلس الدماغ.
   ملاحظة: اضبط قيم المحاور x وy وz وفقا لاتجاه ومسافة انحراف نقطة الحقن. قد يكون من الضروري تكرار كافة الخطوات في هذا البروتوكول عدة مرات لتحديد الإحداثيات بدقة.

النتائج

نجحت هذه الدراسة في تحديد موقع الحقن في غضون 30 دقيقة باستخدام الطريقة المثبتة. في البداية ، تم حقن محلول تحميل عينة SDS-PAGE يحتوي على بروموفينول أزرق في LDTgV في الفئران C57 / BL. يوضح الشكل 1 أ تمثيلا تخطيطيا لحقن محلول الصبغة. يوضح الشكل 1 ب توزيع الصبغة الزرقاء في LDT...

Discussion

وصفت هذه المقالة استراتيجية مستقرة للتحقق من دقة حقن الدماغ التجسيمية ^5,6 بسرعة أكبر وببساطة قبل تتبع الفيروس ، ولكن الجانب الذي لا يمكن الاستغناء عنه من التعبير الجيني للمراسل في منطقة الدماغ أمر بالغ الأهمية لوضع العلامات على منطقة الدماغ. سمحت الصبغة الز...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910