Kriyoseksiyon Yoluyla Stereotaksik Enjeksiyon Koordinatlarının Ön Doğrulaması

Özet

Mevcut protokol, boyalar ve donmuş kesitler kullanarak viral izleme yapmadan önce stereotaksik enjeksiyon koordinatlarının doğrulama adımını hızlandırmak için pratik bir stratejiyi açıklamaktadır.

Özet

Belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik enjeksiyonu, temel sinirbilimde temel bir deneysel teknik oluşturur. Araştırmacılar genellikle stereotaksik enjeksiyon parametreleri seçimlerini fare beyin atlaslarına veya çeşitli popülasyonlar / yaşlarda fareler ve farklı stereotaksik ekipman kullanan yayınlanmış materyallere dayandırırlar ve bu da stereotaksik koordinat parametrelerinin daha fazla doğrulanmasını gerektirir. Kalsiyum görüntüleme, kemogenetik ve optogenetik manipülasyonların etkinliği, genellikle birkaç haftalık çaba gerektiren, ilgilenilen bölgedeki raportör genlerin kesin ifadesine dayanır. Bu nedenle, hedef beyin bölgesinin koordinatlarının önceden doğrulanmaması zaman alıcı bir iştir. Virüs yerine uygun bir boya kullanarak ve kriyoseksiyon uygulayarak, araştırmacılar boya uygulamasından hemen sonra enjeksiyon bölgesini gözlemleyebilirler. Bu, gerçek enjeksiyon bölgesi ile teorik konum arasında tutarsızlıkların olduğu durumlarda koordinat parametrelerinde zamanında ayarlamalar yapılmasını kolaylaştırır. Bu tür ayarlamalar, sonraki deneylerde hedef bölge içindeki viral ekspresyonun doğruluğunu önemli ölçüde artırır.

Giriş

İn vivo kalsiyum kaydı, optogenetik ve kemogenetik araçlar dahil olmak üzere neredeyse tüm modern nöromodülasyon araçları, nöral manipülasyonun temelini oluşturan beyin ilgi alanını ^1,2,3 hedeflemek için stereotaksik koordinatların kullanılmasını gerektirir. Fare beyin bölgeleri için stereotaksik koordinatlar, kafatası üzerindeki kemikli yer işaretleri olan bregma ve lambda ile ilişkili olarak tanımlanır ve kafatasından türetilmiş stereotaksik koordinat sistemini oluşturur. Ya bregma ya da lambda, üç boyutlu koordinatların sıfır noktası olarak hizmet edebilir. Üç eksen anteroposterior (AP), mediolateral (ML) ve dorsoventral (DV) olup, stereotaksik aletlerin dijital ekranında y, x ve z eksenlerini temsil eder. İyi bilinen beyin bölgeleri için, belirli bir alanın stereotaksik koordinat parametreleri, fare beyin atlaslarından⁴ (örneğin, stereotaksik koordinatlarda Paxinos ve Franklin'in fare beyni) ve/veya yayınlanmış literatürden ^5,6 elde edilebilir. Bununla birlikte, stereotaksik ekipmandaki farklılıklar ve farklı araştırmacılar tarafından kullanılan farelerin yaşı / popülasyonları nedeniyle daha fazla doğrulama gereklidir.

Yapı, işlevin temelidir. Nöral devreler, bilişsel aktiviteler, duygu, hafıza, duyusal ve motor işlevler gibi birçok beyin fonksiyonunun temelini oluşturur¹. Nöral devrelerin yapısını etiketlemek ve aktivitesini manipüle etmek, belirli bir nöral devrenin işlevini anlamak için hayati önem taşır. Geçtiğimiz on yıllar boyunca, nöral izleyiciler birçok nesil boyunca gelişti; erken araştırmalar, buğday tohumu aglütinini (WGA) ve phaseolus vulgaris aglütinini (PHA) anterograd izleyiciler olarak ve florogold (FG), kolera toksin alt birimi B (CTB), karbosiyanin retrograd izleyiciler olarak kabul edildi. Bununla birlikte, viral izleyicilerin aksine, bu geleneksel nöral izleyiciler, eksojen genleri konakçıya entegre edemezler ve hücre tipi seçiciliğine sahip değildirler. Günümüzde, viral strateji, temel sinirbilim araştırmaları sırasında önemli bir öneri haline gelmiştir. Farklı araştırma amaçları için çeşitli viral araçlar seçilebilir ^7,8. Transsinaptik olmayan virüsler, trans-multisinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) ve trans-monosinaptik virüsler (retrograd ve anterograd) vardır. Her kategori, ilgili özelliklere sahip birkaç tür içerir.

Viral uygulama ve ekspresyon süreci oldukça zaman ve kaynak yoğundur, genellikle haftalar veya daha uzun sürer. Çeşitli viral vektörler arasında, adeno-ilişkili virüs, deneysel prosedür için enjeksiyondan 3 ila 8 hafta sonra geniş bir pencere sağlayarak, gen iletimi için umut verici bir araç olarak tanımlanmıştır ^7,8. AAV geliştikçe, uygulamadan 2-3 hafta sonra analiz yapılabilir ^9,10. Yalancı kuduz virüsü (PRV) ve kuduz virüsü (RV) gibi diğer nöral devre izleyicileri de en az 2-7 günlük bir izleme süresi gerektirir 11,12,13,14,15. Bu nedenle, floresan sinyallerini gözlemlemeden önce enjeksiyon bölgesinin ön doğrulaması hem zaman hem de maliyet açısından etkilidir.

Stereotaksik enjeksiyonların basit ve hızlı bir şekilde doğrulanmasını kolaylaştırmak için, bu çalışmada, viral vektörlerden önce bir boya uygulanır ve kriyoseksiyon, araştırmacıların enjeksiyon bölgesini gözlemlemelerini ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika içinde izlemelerini sağlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Hayvan Araştırmaları Raporlama İn Vivo Deneyleri (ARRIVE) kılavuzlarına ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma, Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Renji Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için sekiz haftalık C57BL / 6J erkek fareler kullanıldı. Hayvanlar ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve standart kafeslerde (22 °C ± 2 °C, 12 saat/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü, yiyecek ve su ad libitum) barındırıldı.

1. Hedef beyin bölgelerinin seçimi

NOT: Bu steril bir işlemdir. Tüm cerrahi aletlerin sterilize edildiğinden emin olun. Cerrahi aletlerle temas etmeden önce eldivenlere alkol püskürtün. Aletlerin ucuna veya cerrahi bölgeye eldivenle dokunmaktan kaçının. Prosedüre başlamadan önce, doğru reflekslerin kaybını ve kutanöz stimülasyona yanıt verilmemesini kontrol ederek farenin yeterince uyuşturulduğundan emin olun. Delme ve enjeksiyondan önce, solunum hızını (dakikada 60-220 nefes, dakikada ortalama 100-150 nefes) ve solunum genliğini (tutarlı olmalı ve aşırı sığ veya derin olmamalıdır) yakından izleyin. Solunum hızı veya genliğindeki herhangi bir önemli değişiklik not edilmelidir.

1. Fareyi 29 G'lik bir iğne kullanarak% 1.25 tribromoetanol (250 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Doğrultma refleksi ortadan kalktığında kafatasındaki kılları tıraş edin. Üst kesici dişleri bir burun kelepçesi ile sabitleyerek ve iki kulak çubuğu kullanarak başı sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürün. Saç derisini Anerdian (dezenfektan solüsyonu; Malzeme Tablosuna bakınız) ile üç kez sürünerek dezenfekte edin. Lokal analjezi sağlamak için 29 G insülin iğnesi kullanarak deri altına 0.2 mL% 1 lidokain enjekte edin.
3. Kafatasını ortaya çıkarmak için göz makası kullanarak 0,5 cm'lik bir kesi yapın. Periosteumu çıkarmak için açıkta kalan kafatasını ovalamak için% 3 H₂O₂ ile batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Kafatasının kurumasını bekleyin.
4. Matkabı stereotaksik alete takın. Bir büyüteç yardımıyla matkap ucunu tam olarak bregma'ya konumlandırmak için stereotaksik kolların düğmelerini ayarlayın ve LCD dijital ekranı kullanarak z ekseni değerini kaydedin.
   1. Düğmeleri ayarlayın ve matkap ucunu lambdaya yerleştirin ve z ekseninin değerini kaydedin. Burun kelepçesini ve kulak çubuklarını iki z değerini daha yakın hale getirecek şekilde ayarlayın ve iki z değeri arasındaki fark 0,1 mm'den az olana kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın.
      NOT: LCD dijital ekrandaki x, y ve z eksenleri sırasıyla mediolateral (ML), anteroposterior (AP) ve dorsoventral (DV) eksenlere karşılık gelir. İki z değeri arasındaki fark 0,1 mm'den az olduğunda, bregma ve lambda'nın aynı yatay düzlemde olduğu düşünülebilir.
5. Beynin sol-sağ düzlüğünden emin olun. Stereotaksik çerçeveye bağlı kulak çubuklarını aynı ölçekte ayarlayın. Örneğin laterodorsal tegmental çekirdeği, ventral kısmı (LDTgV) ele alalım; Paxinos ve Franklin'in fare beyin atlası^16'ya göre stereotaksik koordinatları x için -5.2, y için +0.8, z için -4.0'dır.
   1. Dorsal-ventral yönde z değerini ölçmek için matkabı (-5.2, +0.8) yapmak için kulak çubuğunu ayarlayın ve z değerini ölçmek için matkabı (-5.2, -0.8) konumuna getirin.
      NOT: İki z değeri arasındaki fark 0,2 mm'den az olduğunda sol-sağ eşit seviyede kabul edilir. Dış kulak içi kulak eti simetrik olduğu için kulak bantlarının doğru yere yerleştirilmesi gerekir. İki z değeri arasındaki fark 0,5 mm'den fazlaysa, kulak çubuğu yanlış yere takılmış olabilir.
6. Matkabı tekrar bregma'ya yerleştirin ve LCD dijital ekrandaki üç koordinatı sıfıra ayarlayın. Referans koordinatlarını kullanarak matkabı ilgilenilen bölgenin üzerine yerleştirin. Matkabı başlatın.
   1. Dikey kolu kullanarak matkabı kafatasına nüfuz edene kadar kademeli olarak indirin. Pamuklu çubuklar kullanarak kalıntıları ve kanı temizleyin.
      NOT: Beyin dokusuna zarar vermemeye dikkat edin.

2. Boya çözeltisinin hazırlanması ve beyin mikroenjeksiyonu

1. Bromofenol mavisi içeren 25 μL SDS-PAGE yükleme tamponunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 200 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne alın. Boya çözeltisini hazırlamak için tüpe 50 μL ddH₂O ekleyin.
2. Kafatası penceresini tuzlu suyla nemlendirilmiş pamuklu bir bezle örtün. Salini tekrar tekrar aspire ederek ve dışarı atarak mikroşırınga açıklığını sağlayın. Mikro şırıngaya 0,3 μL boya yükleyin. Şırıngayı ve motorlu stereotaksik mikroenjektörü stereotaksik kola takın.
3. Şırınga ucunu bregma'ya yerleştirin ve LCD dijital ekranda koordinatları sıfıra ayarlayın. İğneyi referans koordinatlarına göre ilgilenilen bölgeye göre ayarlayın. Enjeksiyon hızını 0,1 μL/dk'ya ayarlayın ve motorlu mikroenjektörü çalıştırarak hedef bölgeye 0,3 μL mavi boya verin. Enjektörü yavaşça çekmeden önce şırıngayı en az 10 dakika yerinde bırakın.
   NOT: Yakın konumdaki bölgeleri ayırt etmek için aynı farelerde farklı renk boyalar kullanılabilir. Diğer boyaları fiziksel özelliklerine göre uygun konsantrasyonlar için test edin. Tıkanmaları önlemek için bromofenol mavisi formülünün kullanılması ve kullanımdan önce ve sonra şırınganın iyice durulanması önerilir. Enjeksiyon hacimlerini boya difüzyonuna göre ayarlayın.

3. Beyin dokusu hasadı ve kriyoseksiyon

1. Fareyi stereotaksik çerçeveden serbest bırakın. Fareyi 29 G'lik bir iğne kullanarak 50 mg / kg pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Fareyi bantlı bir köpük tahtaya sabitleyin.
2. Hızlı boğulmaya neden olmak için toraksın her iki tarafını da açın. Sağ atriyal apendikste 1-2 mm'lik bir kesi yapın. Sol ventriküle bir infüzyon iğnesi yerleştirin. 20 mL önceden soğutulmuş salin ve 20 mL buzlu% 4 paraformaldehit çözeltisi demleyin.
3. Fareyi doku diseksiyon makasıyla dekapitasyon yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Boyundan buruna kadar orta hat boyunca bir kesi yaparak cildi çıkarın ve ardından kafatasını ortaya çıkarın. Forseps veya makasla kafatasındaki artık kasları temizleyin.
4. İnce makasın bir bıçağının ucunu, foramen magnum ile beyin arasına, keskin kenarı kemiğe bakacak şekilde, orta sagital sütürün rostral ucuna yerleştirin. Kafatasını orta sagital sütür boyunca kaydırmaya ve kesmeye devam edin. Kafatasını çıkarmak için forseps kullanın ve açıkta kalan beyni ortaya çıkarın.
   NOT: Operasyon sırasında beyne herhangi bir zarar vermemek için dikkatli olun. Kemik parçalarını çıkarmadan önce, kafatasına yapışmış olabilecek meninksleri dikkatlice soyun. Bu önlem, işlem sırasında beyin dokusunun yanlışlıkla kesilmesini önlemek için çok önemlidir.
5. Döner mikrotom kriyostatının gücünü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve oda sıcaklığını -20 °C'ye ayarlayın. Numune diskinin yüzeyini eşit şekilde kaplamak için biraz OCT bileşiği dökün. Kriyo odasına yerleştirin ve OCT'nin katılaşmasına izin verin.
6. Diski numune kafasına takın. Bıçağı bloğa yaklaştırın ve diske paralel düz bir düzlem oluşturmak için OCT bloğunu kesin.
7. Beyni, bir tıraş bıçağı ile bir beyin dilimi kalıbında enjeksiyon bölgesinden uzakta koronal bir yönde kesin. Enjeksiyon bölgesini içeren beyin dokusunu, kesik tarafı aşağı bakacak şekilde OCT düz düzlemine yerleştirin.
   1. OCT'yi beynin üzerine dökün ve diski kriyo odasına koyun, böylece numune bloğunun katılaşmasına izin verin. Beyin OCT ile tamamen gömülü olana kadar OCT'yi tekrar tekrar beyne dökün.
      NOT: OCT bileşiğini katman katman ekleyin. Önceki OCT tabakası dondurulduktan sonra, sonraki OCT bileşiği tabakasını beynin üzerine dökün.
8. Hedef bölge yaklaşana kadar numune bloğunu kesin. Enjeksiyon bölgesi seviyesinden birkaç bölüm yapın. Koronal beyin dilimlerini, -20 ° C'de tutulan küçük bir yazı fırçası kullanarak oda sıcaklığında PBS içeren 6 oyuklu bir plakaya toplayın.
   NOT: Bloğu kesmek için kesme kalınlığını daha büyük bir kalınlığa ayarlayın ve ardından bıçak enjeksiyon bölgesine yaklaşırken kesme kalınlığını 40 μm'ye ayarlayın. Nöral devre izleyicileri kullanılırsa, fareler hemen feda edilmez. Anesteziden kurtulmak için fareyi steril, ameliyat sonrası bir kurtarma kafesine bir ısıtma battaniyesi üzerine yerleştirin. Fareleri uyandıktan sonra orijinal kafese veya yeni bir kafese geri koyun.

4. Görüntüleme

1. OCT'yi oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Beyin bölümlerini almak ve bir slayta yerleştirmek için bir fırça kullanın. Bölümlerin oda sıcaklığında kurumasına izin verin.
2. Enjekte edilen bölgeyi görsel olarak gözlemleyin veya hedef çekirdekler çok küçük olduğunda mikroskop kullanın. Enjekte edilen boyanın yerini beyin atlasındaki ilgili bölge ile karşılaştırın.
   NOT: x, y ve z eksenlerinin değerlerini, enjeksiyon noktası sapmasının yönüne ve mesafesine göre ayarlayın. Koordinatları doğru bir şekilde belirlemek için bu protokoldeki tüm adımları birden çok kez tekrarlamak gerekebilir.

Sonuçlar

Bu çalışma, gösterilen yöntemi kullanarak enjeksiyon bölgesini 30 dakika içinde başarıyla tanımladı. Başlangıçta, bromofenol mavisi içeren bir SDS-PAGE numune yükleme çözeltisi, C57 / BL farelerinde LDTgV'ye enjekte edildi. Şekil 1A , boya çözeltisi enjeksiyonunun şematik bir gösterimini göstermektedir. LDTgV'deki mavi boyanın dağılımı Şekil 1B'de gösterilmiştir.

Bromofenol mavisi ayrıca bu protokolün...

Tartışmalar

Bu makale, stereotaksik beyin enjeksiyonlarının ^5,6 doğruluğunu viral izlemeden önce daha hızlı ve basit bir şekilde doğrulamak için istikrarlı bir strateji tanımlamıştır, ancak beyin bölgesindeki raportör gen ekspresyonunun yeri doldurulamaz yönü, beyin bölgesi etiketlemesi için çok önemlidir. Kullandığımız mavi boya, enjeksiyon bölgesinin hemen görselleştirilmesine izin verdi.

Bu protokoldeki birkaç kri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910