Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

요약

본 프로토콜은 염료 및 동결 절편을 사용하여 바이러스 추적을 수행하기 전에 입체탁 주입 좌표의 검증 단계를 신속하게 처리하기 위한 실용적인 전략을 설명합니다.

초록

특정 뇌 부위에 대한 입체적 주입은 기초 신경과학의 기본적인 실험 기법입니다. 연구자들은 일반적으로 마우스의 다양한 개체군/연령 및 다양한 입체 장비를 사용한 마우스 뇌 아틀라스 또는 발표된 자료에 따라 입체탁스 주입 매개변수를 선택하므로 입체 좌표 매개변수에 대한 추가 검증이 필요합니다. 칼슘 이미징, 화학유전학 및 광유전학 조작의 효능은 관심 영역 내 리포터 유전자의 정확한 발현에 달려 있으며, 종종 몇 주간의 노력이 필요합니다. 따라서 대상 뇌 영역의 좌표를 미리 확인하지 않으면 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 바이러스 대신 적절한 염료를 사용하고 동결 절제를 구현하면 연구원은 염료 투여 직후 주입 부위를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 실제 사출 부위와 이론적 위치 사이에 불일치가 있는 경우 좌표 매개변수를 적시에 조정할 수 있습니다. 이러한 조정은 후속 실험에서 표적 영역 내에서 바이러스 발현의 정확도를 크게 향상시킵니다.

서문

생체 내 칼슘 기록, 광유전학 및 화학유전학 도구를 포함한 거의 모든 현대 신경 조절 도구는 신경 조작의 기초를 형성하는 뇌 관심 영역 ^1,2,3을 표적으로 하기 위해 입체 좌표를 사용해야 합니다. 쥐의 뇌 영역에 대한 입체 좌표는 두개골의 뼈 랜드 마크인 브레그마 (bregma)와 람다 (lambda)와 관련하여 정의되며, 소위 두개골 유래 입체 좌표계를 형성합니다. bregma 또는 lambda는 3차원 좌표의 영점 역할을 할 수 있습니다. 3개의 축은 전후(AP), 내측(ML) 및 등쪽(DV)으로, 입체 기기의 디지털 디스플레이에서 y, x 및 z축을 나타냅니다. 잘 알려진 뇌 영역의 경우, 특정 영역의 입체 좌표 매개변수는 마우스 뇌 아틀라스(mouse brain atlases)⁴(예: 입체 좌표에서의 팍시노스(Paxinos) 및 프랭클린의 마우스 뇌) 및/또는 발표된 문헌 ^5,6으로부터 얻어질 수 있다. 그러나 입체 택시 장비의 다양성과 다른 연구자가 사용하는 마우스의 연령/개체군으로 인해 추가 검증이 필요합니다.

구조는 기능의 기초입니다. 신경 회로는 인지 활동, 감정, 기억, 감각 및 운동 기능과 같은 많은 뇌 기능의 기초를 형성합니다¹. 구조를 분류하고 신경 회로의 활동을 조작하는 것은 특정 신경 회로의 기능을 이해하는 데 필수적입니다. 지난 수십 년 동안 신경 추적자는 여러 세대에 걸쳐 진화해 왔습니다. 초기 연구에서는 밀 배아 응집체(WGA) 및 위상 올루스 불가리스 응집체(PHA)를 전행 추적자로, 플루오로골드(FG), 콜레라 독소 소단위 B(CTB), 카보시아닌을 역행 추적자로 채택했습니다. 그러나 바이러스 추적자와 달리 이러한 전통적인 신경 추적자는 외인성 유전자를 숙주에 통합할 수 없으며 세포 유형 선택성도 없습니다. 오늘날 바이러스 전략은 기초 신경 과학 연구에서 중요한 제안이 되었습니다. 다양한 연구 목적을 위해 다양한 바이러스 도구를 선택할 수 있습니다 ^7,8. non-trans-transsynaptic virus, trans-multisynaptic virus(역행 및 전행성) 및 trans-monosynaptic virus(역행 및 전행성 바이러스)가 있습니다. 각 범주에는 각각의 특성을 가진 여러 유형이 포함되어 있습니다.

바이러스 투여 및 발현 과정은 시간과 자원이 많이 소요되며 종종 몇 주 또는 그 이상이 걸립니다. 다양한 바이러스 벡터 중에서, 아데노 관련 바이러스는 유전자 전달을 위한 유망한 수단으로 확인되었으며, 실험 절차 ^7,8에서 주입 후 3주에서 8주에 이르는 넓은 기간을 제공합니다. AAV가 발전함에 따라, 분석은 투여 후 2-3주 후에 수행할 수 있다 ^9,10. 가성 광견병 바이러스(PRV) 및 광견병 바이러스(RV)와 같은 다른 신경 회로 추적자도 최소 2-7일의 추적 기간을 필요로 합니다 11,12,13,14,15. 따라서 형광 신호를 관찰하기 전에 주입 부위를 미리 검증하는 것은 시간적으로나 비용 효율적입니다.

입체적 주입의 간단하고 신속한 검증을 용이하게 하기 위해 이 연구에서는 바이러스 벡터 전에 염료를 투여하고 동결 절개를 통해 연구원은 주입 부위를 관찰하고 주입 후 30분 이내에 추적할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물실험은 ARRIVE(Animal Research Reporting In Vivo Experiments) 가이드라인 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 상하이 교통대학교 의과대학 렌지 병원(Renji Hospital)의 동물 보호 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 8주령의 C57BL/6J 수컷 마우스가 사용되었다. 동물은 상업적으로 획득되었고( 재료 표 참조) 표준 케이지(22°C ± 2°C, 12시간/12시간 명암주기, 음식 및 물)에 수용되었습니다.

1. 표적 뇌 영역의 선택

알림: 이것은 멸균 절차입니다. 모든 수술 기구가 멸균되었는지 확인하십시오. 수술 기구에 닿기 전에 장갑에 알코올을 뿌립니다. 기구의 끝부분이나 수술 부위를 장갑으로 만지지 마십시오. 시술을 시작하기 전에 오른쪽 반사 신경의 손실과 피부 자극에 대한 반응이 없는지 확인하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 드릴링 및 주입 전에 호흡수(분당 60-220회 호흡, 분당 평균 100-150회 호흡)와 호흡 진폭(일관성이 있어야 하며 과도하게 얕거나 깊지 않아야 함)을 면밀히 모니터링하십시오. 호흡수 또는 진폭의 중요한 변화를 기록해야 합니다.

1. 29G 바늘을 사용하여 1.25% 트리브로모에탄올(250mg/kg)의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 오른쪽 반사가 사라지면 두개골의 머리카락을 면도하십시오. 노즈 cl로 위쪽 앞니를 고정하여 마우스를 입체 프레임( 재료 표 참조)에 고정합니다.amp 두 개의 이어 바를 사용하여 머리를 고정합니다.
2. 안구 건조증을 예방하기 위해 안과 연고를 바르십시오. Anerdian(소독액, 재료 표 참조)으로 두피를 세 번 닦아 소독합니다. 29G의 인슐린 바늘을 사용하여 1% 리도카인 0.2mL를 피하에 주사하여 국소 진통을 제공합니다.
3. 눈 가위로 0.5cm를 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 3 % H₂O₂ 를 적신 면봉을 사용하여 노출 된 두개골을 문질러 골막을 제거합니다. 두개골을 말리십시오.
4. 드릴을 입체 악기에 부착합니다. 돋보기를 사용하여 드릴 팁을 브레그마에 정확하게 배치하도록 입체 암의 손잡이를 조정하고 LCD 디지털 디스플레이를 사용하여 z축 값을 기록합니다.
   1. 손잡이를 조정하고 드릴 팁을 람다에 놓고 z축의 값을 기록합니다. 노즈 클램프와 이어 바를 조정하여 두 개의 z 값을 더 가깝게 만들고 두 z 값 간의 차이가 0.1mm 미만이 될 때까지 위의 단계를 반복합니다.
      참고: LCD 디지털 디스플레이의 x, y 및 z축은 각각 내측(ML), 전후(AP) 및 배측(DV)에 해당합니다. bregma와 lambda는 두 z 값의 차이가 0.1mm 미만이면 동일한 수평면에 있는 것으로 간주할 수 있습니다.
5. 뇌의 좌우 수평을 보장합니다. 스테레오택시 프레임에 부착된 이어 바를 동일한 스케일로 조정합니다. 예를 들어 laterodorsal tegmental nucleus, ventral part (LDTgV)를 사용하십시오. Paxinos와 Franklin의 쥐 뇌 아틀라스¹⁶에 따르면 입체 좌표는 x의 경우 -5.2, y의 경우 +0.8, z의 경우 -4.0입니다.
   1. 이어 바를 조정하여 드릴을 (-5.2, +0.8)으로 하여 등쪽-복부 방향의 z 값을 측정하고 드릴을 (-5.2, -0.8)으로 이동하여 z 값을 측정합니다.
      참고: 왼쪽-오른쪽은 두 z 값의 차이가 0.2mm 미만일 때 동일한 수준으로 간주됩니다. 외이도(external eary meatus)는 대칭을 이루기 때문에 귓바퀴를 올바른 위치에 삽입해야 합니다. 두 z 값의 차이가 0.5mm 이상이면 이어바가 잘못된 위치에 삽입되었을 수 있습니다.
6. 드릴을 다시 브레그마에 놓고 LCD 디지털 디스플레이의 세 좌표를 0으로 설정합니다. 참조 좌표를 사용하여 관심 영역 위에 드릴을 배치합니다. 훈련을 시작합니다.
   1. 두개골을 관통할 때까지 수직 암을 사용하여 드릴을 점차적으로 내립니다. 면봉을 사용하여 부스러기와 피를 제거합니다.
      알림: 뇌 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오.

2. 염료 용액 및 뇌 미세 주입 준비

1. 브로모페놀 블루( 재료 표 참조)를 함유한 25μL의 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 200μL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 50 μL의 ddH₂O를 튜브에 첨가하여 염료 용액을 준비합니다.
2. 식염수를 적신 면봉으로 두개골 창을 덮습니다. 식염수를 반복적으로 흡입하고 배출하여 마이크로 주사기 개통을 보장합니다. 0.3μL의 염료를 마이크로 주사기에 넣습니다. 주사기와 전동식 스테레오택스 마이크로인젝터를 스테레오택스 암에 부착합니다.
3. 주사기 팁을 브레그마에 놓고 LCD 디지털 디스플레이에서 좌표를 0으로 설정합니다. 참조 좌표에 따라 바늘을 관심 영역으로 조정합니다. 사출 속도를 0.1μL/min으로 설정하고 전동식 미세주입기를 시작하여 0.3μL의 파란색 염료를 대상 영역에 전달합니다. 주입기를 천천히 빼내기 전에 주사기를 최소 10분 동안 제자리에 두십시오.
   참고: 밀접하게 위치한 영역을 구별하기 위해 동일한 마우스에 다른 색상의 염료를 사용할 수 있습니다. 물리적 특성에 따라 적절한 농도에 대해 다른 염료를 테스트합니다. 브로모페놀 블루 포뮬러를 사용하고 막힘을 방지하기 위해 사용 전후에 주사기를 철저히 헹구는 것이 좋습니다. 염료 확산에 따라 주입량을 조정합니다.

3. 뇌 조직 채취 및 냉동 절개

1. 스테레오택시 프레임에서 마우스를 놓습니다. 29G 바늘을 사용하여 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사로 마우스를 마취합니다. 테이프로 폼 보드에 마우스를 고정합니다.
2. 흉부의 양쪽을 열어 빠른 질식을 유도합니다. 우측 심방 부속기를 1-2mm 절개합니다. 좌심실에 주입 바늘을 삽입합니다. 20mL의 예냉식 식염수와 20mL의 아이스 4% 파라포름알데히드 용액을 주입합니다.
3. 조직 해부 가위로 쥐의 목을 베십시오(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 목에서 코까지 정중선을 따라 절개하여 피부를 제거한 다음 두개골을 노출시킵니다. 집게나 가위로 두개골에 남아 있는 근육을 제거합니다.
4. 가는 가위의 한쪽 날 끝을 구멍과 뇌 사이에 놓고 날카로운 모서리가 뼈를 향하도록 하여 시상 중간 봉합사의 끝에 놓습니다. 중시상 봉합사를 따라 두개골을 밀어 절단합니다. 집게를 사용하여 두개골을 제거하면 노출된 뇌가 드러납니다.
   알림: 수술 중 뇌에 손상을 입히지 않도록 주의하십시오. 뼛조각을 제거하기 전에 두개골에 붙어 있을 수 있는 수막을 조심스럽게 벗겨냅니다. 이 예방 조치는 그 과정에서 뇌 조직이 부주의하게 절단되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
5. 회전식 마이크로톰 cryostat( 재료 표 참조)의 전원을 켜고 챔버 온도를 -20°C로 설정합니다. 시편 디스크의 표면을 고르게 덮기 위해 약간의 OCT 화합물을 붓습니다. 그것을 cryo 챔버에 넣고 OCT가 응고되도록 합니다.
6. 디스크를 시편 헤드에 부착합니다. 블레이드를 블록에 더 가깝게 가져오고 OCT 블록을 잘라 디스크와 평행한 평평한 평면을 만듭니다.
7. 주사 부위에서 멀리 떨어진 관상 방향으로 뇌를 면도날로 뇌 절편 금형에 절릅니다. 주사 부위가 들어있는 뇌 조직을 절단면이 아래로 향하게 하여 OCT 평면에 놓습니다.
   1. OCT를 뇌에 붓고 디스크를 냉동 챔버에 넣어 표본 블록이 응고되도록 합니다. 뇌에 OCT가 완전히 포함될 때까지 OCT를 뇌에 반복적으로 붓습니다.
      참고: OCT 화합물을 층별로 추가합니다. OCT의 이전 층이 얼면 OCT 화합물의 다음 층을 뇌에 붓습니다.
8. 대상 영역이 접근할 때까지 시편 블록을 자릅니다. 주입 부위 수준에서 여러 섹션을 만듭니다. -20 °C에서 유지되는 작은 필기 브러시를 사용하여 실온 PBS가 들어 있는 6웰 플레이트에 관상 뇌 절편을 수집합니다.
   참고: 절단 두께를 더 큰 것으로 설정하여 블록을 자른 다음 블레이드가 사출 부위에 접근함에 따라 절단 두께를 40μm로 설정합니다. 신경 회로 추적자를 사용하면 마우스가 즉시 희생되지 않습니다. 마취 회복을 위해 가열 담요 위에 무균 수술 후 회복 케이지에 마우스를 놓습니다. 생쥐를 원래 케이지로 돌려보내거나 깨어난 후 새 케이지로 되돌려 놓습니다.

4. 이미징

1. 실온 PBS로 OCT를 세척하십시오. 브러시를 사용하여 뇌 부분을 집어 슬라이드에 놓습니다. 섹션을 실온에서 공기 건조시킵니다.
2. 주입된 부위를 육안으로 관찰하거나 표적 핵이 미세할 때 현미경을 사용합니다. 주입된 염료의 위치를 뇌 아틀라스의 해당 영역과 비교합니다.
   참고: 주입 지점 편차의 방향과 거리에 따라 x, y, z축의 값을 조정합니다. 좌표를 정확하게 결정하기 위해 이 프로토콜의 모든 단계를 여러 번 반복해야 할 수도 있습니다.

결과

이 연구는 입증된 방법을 사용하여 30분 이내에 주입 부위를 성공적으로 식별했습니다. 처음에는 브로모페놀 블루를 함유한 SDS-PAGE 샘플 로딩 용액을 C57/BL 마우스의 LDTgV에 주입했습니다. 그림 1A 는 염료 용액 주입의 개략도를 보여줍니다. LDTgV에서 청색 염료의 분포는 그림 1B에 나와 있습니다.

브로모페놀 블루는 또한 이 프로토콜?...

토론

이 논문은 바이러스 추적 전에 입체적 뇌 주입 ^5,6의 정확성을 더 빠르고 간단하게 검증할 수 있는 안정적인 전략을 설명했지만, 뇌 영역에서 리포터 유전자 발현의 대체 불가능한 측면은 뇌 영역 라벨링에 매우 중요합니다. 우리가 사용한 파란색 염료는 주입 부위를 즉시 시각화할 수 있었습니다.

이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910