Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

요약

본 프로토콜은 염료 및 동결 절편을 사용하여 바이러스 추적을 수행하기 전에 입체탁 주입 좌표의 검증 단계를 신속하게 처리하기 위한 실용적인 전략을 설명합니다.

초록

특정 뇌 부위에 대한 입체적 주입은 기초 신경과학의 기본적인 실험 기법입니다. 연구자들은 일반적으로 마우스의 다양한 개체군/연령 및 다양한 입체 장비를 사용한 마우스 뇌 아틀라스 또는 발표된 자료에 따라 입체탁스 주입 매개변수를 선택하므로 입체 좌표 매개변수에 대한 추가 검증이 필요합니다. 칼슘 이미징, 화학유전학 및 광유전학 조작의 효능은 관심 영역 내 리포터 유전자의 정확한 발현에 달려 있으며, 종종 몇 주간의 노력이 필요합니다. 따라서 대상 뇌 영역의 좌표를 미리 확인하지 않으면 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 바이러스 대신 적절한 염료를 사용하고 동결 절제를 구현하면 연구원은 염료 투여 직후 주입 부위를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 실제 사출 부위와 이론적 위치 사이에 불일치가 있는 경우 좌표 매개변수를 적시에 조정할 수 있습니다. 이러한 조정은 후속 실험에서 표적 영역 내에서 바이러스 발현의 정확도를 크게 향상시킵니다.

서문

생체 내 칼슘 기록, 광유전학 및 화학유전학 도구를 포함한 거의 모든 현대 신경 조절 도구는 신경 조작의 기초를 형성하는 뇌 관심 영역 ^1,2,3을 표적으로 하기 위해 입체 좌표를 사용해야 합니다. 쥐의 뇌 영역에 대한 입체 좌표는 두개골의 뼈 랜드 마크인 브레그마 (bregma)와 람다 (lambda)와 관련하여 정의되며, 소위 두개골 유래 입체 좌표계를 형성합니다. bregma 또는 lambda는 3차원 좌표의 영점 역할을 할 수 있습니다. 3개의 축은 전후(AP), 내측(ML) 및 등쪽(DV)으로, 입체 기기의 디지털 디스플레이에서 y, x 및 z축을 나타냅니다. 잘 알려진 뇌 영역의 경우, 특정 영역의 입체 좌표 매개변수는 마우스 뇌 아틀라스(mouse brain atlases)⁴(예: 입체 좌표에서의 팍시노스(Paxinos) 및 프랭클린의 마우스 뇌) 및/또는 발표된 문헌 ^5,6으로부터 얻어질 수 있다. 그러나 입체 택시 장비의 다양성과 다른 연구자가 사용....

프로토콜

모든 동물실험은 ARRIVE(Animal Research Reporting In Vivo Experiments) 가이드라인 및 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 상하이 교통대학교 의과대학 렌지 병원(Renji Hospital)의 동물 보호 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 8주령의 C57BL/6J 수컷 마우스가 사용되었다. 동물은 상업적으로 획득되었고( 재료 표 참조) 표준 케이지(22°C ± 2°C, 12시간/12시간 명암주기, 음식 및 물)에 수용되었습니다.

1. 표적 뇌 영역의 선택

알림: 이것은 멸균 절차입니다. 모든 수술 기구가 멸균되었는지 확인하십시오. 수술 기구에 닿기 전에 장갑에 알코올을 뿌립니다. 기구의 끝부분이나 수술 부위를 장갑으로 만지지 마십시오. 시술을 시작하기 전에 오른쪽 반사 신경의 손실과 피부 자....

토론

이 논문은 바이러스 추적 전에 입체적 뇌 주입 ^5,6의 정확성을 더 빠르고 간단하게 검증할 수 있는 안정적인 전략을 설명했지만, 뇌 영역에서 리포터 유전자 발현의 대체 불가능한 측면은 뇌 영역 라벨링에 매우 중요합니다. 우리가 사용한 파란색 염료는 주입 부위를 즉시 시각화할 수 있었습니다.

이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910