通过冷冻切片初步验证立体定向注射坐标

摘要

本方案描述了一种实用策略，用于在使用染料和冷冻切片进行病毒示踪之前加快立体定位注射坐标的验证步骤。

摘要

特定大脑区域的立体定向注射构成了基础神经科学中的一项基本实验技术。研究人员通常根据小鼠脑图谱或已发表的材料来选择立体定位注射参数，这些材料采用了不同群体/年龄的小鼠和不同的立体定位设备，因此需要进一步验证立体定位坐标参数。钙成像、化学遗传学和光遗传学操作的功效依赖于感兴趣区域内报告基因的精确表达，通常需要数周的努力。因此，如果不事先验证目标大脑区域的坐标，这将是一项耗时的任务。使用适当的染料代替病毒并实施冷冻切片，研究人员可以在染料给药后立即观察注射部位。这有助于在实际注射位置和理论位置之间存在差异的情况下及时调整坐标参数。在随后的实验中，这种调整显著提高了靶区域内病毒表达的准确性。

引言

几乎所有现代神经调控工具，包括体内钙记录、光遗传学和化学遗传学工具，都需要使用立体定位坐标来靶向感兴趣的大脑区域 ^1,2,3，从而形成神经操作的基础。小鼠大脑区域的立体定位坐标是相对于前囟和λ（颅骨上的骨标志）定义的，形成了所谓的颅骨衍生的立体定位坐标系统。bregma 或 lambda 都可以用作三维坐标的零点。这三个轴是前后轴 （AP）、内外侧轴 （ML） 和背腹轴 （DV），代表立体定位仪器数字显示屏上的 y、x 和 z 轴。对于众所周知的大脑区域，特定区域的立体定位坐标参数可以从小鼠脑^图谱4（例如，Paxinos和Franklin的小鼠大脑在立体定位坐标中）和/或已^{发表的文献5,6}中获得。然而，由于立体定位设备的变化和不同研究人员使用的小鼠的年龄/群体，需要进一步验证。

结构是功能的基础。神经回路构成了许多大脑功能的基础，例如认知活动、情绪、记忆、感觉和运动功能¹.标记结构和操纵神经回路的活动对于理解特定神经回路的功能至关重要。在过去的几十年里，神经示踪剂....

研究方案

所有动物实验均按照《动物研究报告体内实验》（ARRIVE）指南和美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。本研究经上海交通大学医学院附属仁济医院动物护理与使用专业委员会批准。本研究采用8周龄C57BL/6J雄性小鼠。这些动物是商业获得的（见 材料表）并饲养在标准笼子中（22°C±2°C，12小时/ 12小时光照/黑暗循环，食物和水随意）。

1. 目标脑区域的选择

注意：这是一个无菌程序。确保所有手术器械都经过消毒。在接触手术器械之前，用酒精喷洒手套。避免戴手套触摸器械尖端或手术区域。在开始手术之前，通过检查矫正反射的丧失和对皮肤刺激没有反应，确保小鼠得到充分麻醉。在钻孔和注射之前，密切监测呼吸频率（每分钟60-220次呼吸，平均每分钟100-150次呼吸）和呼吸幅度（应保持一致，不要过浅或过深）。应注意呼吸频率或振幅的任何显着变化。

1. 使用29G针头腹膜内注射1.25%三溴乙醇（250mg / kg）麻醉小鼠。一旦矫正反射消失，就剃掉头骨上的毛发。用鼻夹固定上门牙并使用两个耳杆稳定头部，将鼠标固定在立体定位框架中（参见 材料表）。
2. 使用眼药膏以防止眼睛干燥。用 Anerdian（消毒溶液;见 材料表）擦拭头皮三次对头皮进行消毒。使用 29 G....

讨论

本文描述了一种稳定的策略，可以在病毒追踪之前更快、更简单地验证立体定向脑注射的准确性 ^5,6，^但报告基因在大脑区域表达的不可替代性对于大脑区域标记至关重要。我们使用的蓝色染料可以立即看到注射部位。

该协议中的几个关键步骤有助于提高注射部位的准确性。首先，从步骤1.5开始，确保大脑在立体定位仪中的左右水?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910