Validación preliminar de las coordenadas de inyección estereotáxica mediante criosección

Resumen

El presente protocolo describe una estrategia práctica para acelerar la etapa de verificación de las coordenadas de inyección estereotáxica antes de realizar el rastreo viral utilizando tintes y secciones congeladas.

Resumen

La inyección estereotáxica de una región específica del cerebro constituye una técnica experimental fundamental en la neurociencia básica. Los investigadores suelen basar su elección de los parámetros de inyección estereotáxica en atlas cerebrales de ratón o en materiales publicados que empleaban varias poblaciones/edades de ratones y diferentes equipos estereotáxicos, lo que requiere una mayor validación de los parámetros de coordenadas estereotáxicas. La eficacia de las manipulaciones de imágenes de calcio, quimiogenéticas y optogenéticas se basa en la expresión precisa de los genes indicadores dentro de la región de interés, lo que a menudo requiere varias semanas de esfuerzo. Por lo tanto, es una tarea que requiere mucho tiempo si las coordenadas de la región del cerebro objetivo no se verifican de antemano. Utilizando un tinte apropiado en lugar de un virus e implementando la criosección, los investigadores pueden observar el sitio de inyección inmediatamente después de la administración del tinte. Esto facilita los ajustes oportunos de los parámetros de coordenadas en los casos en que existan discrepancias entre el sitio de inyección real y la posición teórica. Dichos ajustes mejoran significativamente la precisión de la expresión viral dentro de la región objetivo en experimentos posteriores.

Introducción

Casi todas las herramientas modernas de neuromodulación, incluido el registro de calcio in vivo, las herramientas optogenéticas y quimiogenéticas, requieren el uso de coordenadas estereotáxicas para dirigirse al área de interés del cerebro ^1,2,3, formando la base de la manipulación neuronal. Las coordenadas estereotáxicas para las regiones del cerebro del ratón se definen en relación con bregma y lambda, los puntos de referencia óseos en el cráneo, que forman el llamado sistema de coordenadas estereotáxica derivado del cráneo. Tanto el bregma como la lambda pueden se....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de Informes de Investigación en Animales (ARRIVE) y la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El presente estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital Renji de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de ocho semanas de edad. Los animales fueron obtenidos comercialmente (ver Tabla de Materiales) y alojados en jaulas estándar (22 °C ± 2 °C, ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, alimento y agua ad lib....

Discusión

En este artículo se describe una estrategia estable para verificar la precisión de las inyecciones cerebrales estereotáxicas ^5,6 de forma más rápida y sencilla antes del rastreo viral, pero el aspecto insustituible de la expresión del gen reportero en la región cerebral es crucial para el etiquetado de la región cerebral. El tinte azul que utilizamos permitió la visualización inmediata del lugar de la inyección.

Varios pasos.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910