Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

Resumo

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Resumo

A injeção estereotáxica de uma região específica do cérebro constitui uma técnica experimental fundamental na neurociência básica. Os pesquisadores geralmente baseiam sua escolha de parâmetros de injeção estereotáxica em atlas cerebrais de camundongos ou materiais publicados que empregaram várias populações/idades de camundongos e diferentes equipamentos estereotáxicos, necessitando de validação adicional dos parâmetros de coordenadas estereotáxicas. A eficácia das manipulações de imagens de cálcio, quimiogenéticas e optogenéticas depende da expressão precisa de genes repórteres dentro da região de interesse, muitas vezes exigindo várias semanas de esforço. Assim, é uma tarefa demorada se as coordenadas da região alvo do cérebro não forem verificadas com antecedência. Usando um corante apropriado em vez de um vírus e implementando a criossecção, os pesquisadores podem observar o local da injeção imediatamente após a administração do corante. Isso facilita ajustes oportunos para coordenar os parâmetros nos casos em que existem discrepâncias entre o local real da injeção e a posição teórica. Tais ajustes aumentam significativamente a precisão da expressão viral dentro da região-alvo em experimentos subsequentes.

Introdução

Quase todas as ferramentas modernas de neuromodulação, incluindo registro de cálcio in vivo, ferramentas optogenéticas e quimiogenéticas, requerem o uso de coordenadas estereotáxicas para atingir a área de interesse do cérebro ^1,2,3, formando a base da manipulação neural. As coordenadas estereotáxicas para as regiões do cérebro de camundongos são definidas em relação ao bregma e lambda, os marcos ósseos no crânio, formando o chamado sistema de coordenadas estereotáxicas derivado do crânio. Bregma ou lambda podem servir como o ponto zero das coordenadas tridimensionais. Os três eixos são ântero-posterior (AP), mediolateral (ML) e dorsoventral (DV), representando os eixos y, x e z no display digital de instrumentos estereotáxicos. Para regiões cerebrais bem conhecidas, os parâmetros de coordenadas estereotáxicas de uma área específica podem ser obtidos a partir de atlas cerebrais de camundongos⁴ (por exemplo, cérebro de camundongo de Paxinos e Franklin em coordenadas estereotáxicas) e / ou da literatura publicada ^5,6. No entanto, uma validação adicional é necessária devido a variações no equipamento estereotáxico e na idade/populações de camundongos usados por diferentes pesquisadores.

A estrutura é a base da função. Os circuitos neurais formam a base para muitas funções cerebrais, como atividades cognitivas, emoções, memória, funções sensoriais e motoras¹. Rotular a estrutura e manipular a atividade dos circuitos neurais são vitais para entender a função de um circuito neural específico. Nas últimas décadas, os traçadores neurais evoluíram ao longo de muitas gerações; pesquisas iniciais adotaram aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e aglutinina phaseolus vulgaris (PHA) como traçadores anterógrados, e fluoroouro (FG), subunidade B da toxina da cólera (CTB), carbocianina como traçadores retrógrados. No entanto, ao contrário dos marcadores virais, esses traçadores neurais tradicionais não podem integrar genes exógenos ao hospedeiro, nem têm seletividade de tipo de célula. Atualmente, a estratégia viral tornou-se uma proposta importante durante a pesquisa básica em neurociência. Para diferentes fins de pesquisa, várias ferramentas virais podem ser selecionadas ^7,8. Existem vírus não transsinápticos, vírus transmultissinápticos (retrógrados e anterógrados) e vírus transmonossinápticos (retrógrados e anterógrados). Cada categoria contém vários tipos com as respectivas características.

O processo de administração e expressão viral é altamente demorado e intensivo em recursos, muitas vezes levando semanas ou até mais. Dentre os vários vetores virais, o vírus adeno-associado tem sido identificado como um meio promissor para a entrega de genes, proporcionando uma ampla janela que varia de 3 a 8 semanas pós-injeção para o procedimento experimental ^7,8. À medida que a VAA evolui, a análise pode ser realizada 2-3 semanas após a administração ^9,10. Outros traçadores de circuitos neurais, como o vírus da pseudo-raiva (PRV) e o vírus da raiva (RV), também requerem um período de rastreamento de pelo menos 2-7 dias 11,12,13,14,15. Assim, uma verificação preliminar do local da injeção antes de observar os sinais de fluorescência é eficaz em termos de tempo e custo.

Para facilitar uma verificação simples e rápida das injeções estereotáxicas, neste estudo, um corante é administrado antes dos vetores virais, e a criossecção permite que os pesquisadores observem o local da injeção e o rastreiem dentro de 30 minutos após a injeção.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) e o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai. Camundongos machos C57BL/6J com oito semanas de idade foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais) e alojados em gaiolas padrão (22 °C ± 2 °C, ciclo claro/escuro de 12 h/12 h, alimentação e água ad libitum).

1. Seleção de regiões-alvo do cérebro

NOTA: Este é um procedimento estéril. Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos estejam esterilizados. Pulverize as luvas com álcool antes do contato com instrumentos cirúrgicos. Evite tocar na ponta dos instrumentos ou na área cirúrgica com luvas. Certifique-se de que o mouse esteja adequadamente anestesiado antes de iniciar o procedimento, verificando a perda dos reflexos de endireitamento e nenhuma resposta à estimulação cutânea. Antes da perfuração e injeção, monitore de perto a frequência respiratória (60-220 respirações por minuto, média de 100-150 respirações por minuto) e a amplitude respiratória (deve ser consistente e não excessivamente superficial ou profunda). Quaisquer alterações significativas na frequência ou amplitude respiratória devem ser observadas.

1. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (250 mg / kg) usando uma agulha de 29 G. Raspe o cabelo do crânio assim que o reflexo de endireitamento desaparecer. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica (consulte a Tabela de Materiais) fixando os incisivos superiores com uma pinça nasal e estabilizando a cabeça usando duas barras auriculares.
2. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos. Desinfete o couro cabeludo esfregando-o três vezes com Anerdian (solução desinfetante; consulte a Tabela de Materiais). Injete 0,2 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea usando uma agulha de insulina 29 G para fornecer analgesia local.
3. Faça uma incisão de 0,5 cm usando uma tesoura de olho para expor o crânio. Utilize um cotonete embebido em 3% de H₂O₂ para esfregar o crânio exposto para remover o periósteo. Deixe o crânio secar.
4. Fixe a broca no instrumento estereotáxico. Ajuste os botões dos braços estereotáxicos para posicionar a ponta da broca precisamente no bregma com a ajuda de uma lupa e registre o valor do eixo z usando o display digital LCD.
   1. Ajuste os botões e posicione a ponta da broca no lambda e registre o valor do eixo z. Ajuste o nariz clamp e as barras auriculares para aproximar dois valores z e repita as etapas acima até que a diferença entre os dois valores z seja inferior a 0.1 mm.
      NOTA: Os eixos x, y e z no display digital LCD correspondem a mediolateral (ML), anteroposterior (AP) e dorsoventral (DV), respectivamente. O bregma e o lambda podem ser considerados no mesmo plano horizontal, uma vez que a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,1 mm.
5. Garanta o nivelamento esquerda-direita do cérebro. Ajuste as barras auriculares fixadas à armação estereotáxica com a mesma escala. Veja o núcleo tegmental laterodorsal, parte ventral (LDTgV), por exemplo; suas coordenadas estereotáxicas são -5,2 para x, +0,8 para y, -4,0 para z, de acordo com o atlas do cérebro de camundongos de Paxinos e Franklin¹⁶.
   1. Ajuste a barra de orelha para fazer a broca em (-5,2, +0,8) para medir o valor z na direção dorsal-ventral e mova a broca para (-5,2, -0,8) para medir o valor z.
      NOTA: Considera-se que a esquerda-direita está no mesmo nível quando a diferença entre os dois valores z é inferior a 0,2 mm. As barras auriculares precisam ser inseridas no lugar certo porque o conduto auditivo externo é simétrico. Se a diferença entre os dois valores z for superior a 0,5 mm, a barra auricular pode ser inserida no lugar errado.
6. Posicione a broca no bregma novamente e defina três coordenadas no display digital LCD para zero. Posicione a broca acima da região de interesse usando coordenadas de referência. Comece a broca.
   1. Abaixe gradualmente a broca usando o braço vertical até que ela penetre no crânio. Limpe os detritos e o sangue usando cotonetes.
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar o tecido cerebral.

2. Preparação da solução de corante e microinjeção cerebral

1. Pegue 25 μL de tampão de carregamento SDS-PAGE contendo azul de bromofenol (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de microcentrífuga de 200 μL. Adicione 50 μL de ddH₂O ao tubo para preparar a solução de corante.
2. Cubra a janela craniana com um algodão umedecido com solução salina. Garanta a permeabilidade da microsseringa aspirando e expelindo solução salina repetidamente. Coloque 0,3 μL de corante na micro seringa. Conecte a seringa e o microinjetor estereotáxico motorizado ao braço estereotáxico.
3. Posicione a ponta da seringa no bregma e defina as coordenadas para zero no display digital LCD. Ajuste a agulha na região de interesse de acordo com as coordenadas de referência. Defina a velocidade de injeção para 0,1 μL/min e inicie o microinjetor motorizado, fornecendo 0,3 μL de corante azul na região alvo. Deixe a seringa na posição por pelo menos 10 minutos antes de retirar lentamente o injetor.
   NOTA: Corantes de cores diferentes podem ser usados nos mesmos mouses para distinguir regiões próximas. Teste outros corantes para concentrações adequadas com base em suas propriedades físicas. Recomenda-se usar a fórmula azul de bromofenol e enxaguar bem a seringa antes e depois do uso para evitar bloqueios. Ajuste os volumes de injeção com base na difusão do corante.

3. Colheita de tecido cerebral e criossecção

1. Solte o mouse do quadro estereotáxico. Anestesiar o camundongo com uma injeção intraperitoneal de 50 mg / kg de pentobarbital sódico usando uma agulha de 29 G. Prenda o mouse em uma placa de espuma com fita adesiva.
2. Abra os dois lados do tórax para induzir asfixia rápida. Faça uma incisão de 1-2 mm no apêndice atrial direito. Insira uma agulha de perfusão no ventrículo esquerdo. Infundir 20 mL de solução salina pré-resfriada e 20 mL de solução gelada de paraformaldeído a 4%.
3. Decapite o camundongo com uma tesoura de dissecação de tecidos (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Remova a pele fazendo uma incisão ao longo da linha média do pescoço ao nariz e, em seguida, exponha o crânio. Limpe o músculo residual do crânio com uma pinça ou tesoura.
4. Posicione a ponta de uma lâmina da tesoura fina entre o forame magno e o cérebro, com a borda afiada voltada para o osso, na extremidade rostral da sutura sagital média. Prossiga para deslizar e cortar o crânio ao longo da sutura sagital média. Empregue fórceps para remover o crânio, revelando o cérebro exposto.
   NOTA: Tenha cuidado para evitar causar danos ao cérebro durante a operação. Antes de remover as lascas ósseas, retire cuidadosamente quaisquer meninges que possam estar presas ao crânio. Essa precaução é crucial para evitar o corte inadvertido do tecido cerebral durante o processo.
5. Ligue a alimentação do criostato de micrótomo rotativo (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste a temperatura da câmara para -20 °C. Despeje um pouco de composto OCT para cobrir a superfície do disco de amostra uniformemente. Coloque-o na câmara criogênica e deixe o OCT solidificar.
6. Fixe o disco à cabeça da amostra. Aproxime a lâmina do bloco e apare o bloco OCT para fazer um plano plano paralelo ao disco.
7. Corte o cérebro em uma direção coronal longe do local da injeção em um molde de fatia de cérebro por uma lâmina de barbear. Coloque o tecido cerebral que contém o local da injeção com o lado cortado voltado para baixo no plano plano da OCT.
   1. Despeje OCT no cérebro e coloque o disco na câmara criogênica, permitindo que o bloco de amostra se solidifique. Despeje OCT repetidamente no cérebro até que o cérebro esteja totalmente incorporado ao OCT.
      NOTA: Adicione o composto OCT camada por camada. Uma vez que a camada anterior de OCT esteja congelada, despeje a camada subsequente de composto de OCT no cérebro.
8. Apare o bloco de amostra até que a região alvo se aproxime. Faça várias seções a partir do nível do local de injeção. Colete as fatias do cérebro coronal em uma placa de 6 poços contendo PBS em temperatura ambiente usando um pequeno pincel de escrita mantido a -20 ° C.
   NOTA: Defina a espessura de corte para uma maior para aparar o bloco e, em seguida, defina a espessura de corte para 40 μm à medida que a lâmina se aproxima do local de injeção. Se forem usados traçadores de circuitos neurais, os camundongos não serão sacrificados imediatamente. Coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação pós-operatória estéril sobre um cobertor de aquecimento para recuperação da anestesia. Retorne os ratos para a gaiola original ou para uma nova gaiola quando estiverem acordados.

4. Exames por imagem

1. Lave a OCT com PBS em temperatura ambiente. Use um pincel para pegar seções do cérebro e colocá-las em um slide. Deixe as seções secarem ao ar livre em temperatura ambiente.
2. Observe a região injetada visualmente ou use um microscópio quando os núcleos alvo forem minúsculos. Compare a localização do corante injetado com a região correspondente no atlas cerebral.
   NOTA: Ajuste os valores dos eixos x, y e z de acordo com a direção e a distância do desvio do ponto de injeção. Pode ser necessário repetir todas as etapas deste protocolo várias vezes para determinar as coordenadas com precisão.

Resultados

Este estudo identificou com sucesso o local da injeção em 30 minutos usando o método demonstrado. Inicialmente, uma solução de carregamento de amostra SDS-PAGE contendo azul de bromofenol foi injetada no LDTgV nos camundongos C57 / BL. A Figura 1A mostra uma representação esquemática da injeção da solução de corante. A distribuição do corante azul no LDTgV é ilustrada na Figura 1B.

O azul de bromofenol também foi injet...

Discussão

Este artigo descreveu uma estratégia estável para verificar a precisão das injeções cerebrais estereotáxicas ^5,6 mais rápida e simplesmente antes do rastreamento viral, mas o aspecto insubstituível da expressão do gene repórter na região do cérebro é crucial para a rotulagem da região cerebral. O corante azul que usamos permitiu a visualização imediata do local da injeção.

Várias etapas críticas neste protocolo cont...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910