אימות ראשוני של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות באמצעות קריוסקציה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מעשית לזרז את שלב האימות של קואורדינטות הזרקה סטריאוטקסיות לפני ביצוע מעקב נגיפי באמצעות צבעים ומקטעים קפואים.

Abstract

הזרקה סטריאוטקסית של אזור מסוים במוח מהווה טכניקה ניסיונית בסיסית במדעי המוח הבסיסיים. חוקרים בדרך כלל מבססים את בחירתם בפרמטרים של הזרקה סטריאוטקסית על אטלסים של מוח עכבר או חומרים שפורסמו שהשתמשו באוכלוסיות/גילאים שונים של עכברים ובציוד סטריאוטקסי שונה, מה שמחייב אימות נוסף של פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות. היעילות של דימות סידן, מניפולציות כימוגנטיות ואופטוגנטיות מסתמכת על ביטוי מדויק של גנים מדווחים באזור המעניין, הדורש לעתים קרובות מספר שבועות של מאמץ. לכן, זוהי משימה גוזלת זמן אם הקואורדינטות של אזור המוח היעד אינן מאומתות מראש. באמצעות שימוש בצבע מתאים במקום וירוס ויישום קריוסקציה, החוקרים יכולים לצפות באתר ההזרקה מיד לאחר מתן הצבע. זה מאפשר התאמות בזמן כדי לתאם פרמטרים במקרים שבהם קיימים פערים בין אתר ההזרקה בפועל לבין המיקום התיאורטי. התאמות כאלה משפרות באופן משמעותי את דיוק ביטוי הנגיפים באזור המטרה בניסויים הבאים.

Introduction

כמעט כל הכלים הנוירומודולטיביים המודרניים, כולל רישום סידן in vivo, כלים אופטוגנטיים וכימוגנטיים, דורשים שימוש בקואורדינטות סטריאוטקסיות כדי להתמקד באזור המוח המעניין ^1,2,3, ויוצרים את הבסיס למניפולציה עצבית. קואורדינטות סטריאוטקסיות עבור אזורי מוח של עכברים מוגדרות ביחס לברגמה ולמבדה, ציוני הדרך הגרמיים על הגולגולת, ויוצרים את מה שמכונה מערכת קואורדינטות סטריאוטקסית שמקורה בגולגולת. ברגמה או למדא יכולות לשמש כנקודת האפס של הקואורדינטות התלת-ממדיות. שלושת הצירים הם אנטרופוסטריורי (AP), בינוני (ML) ודורסו-ונטרלי (DV), המייצגים את צירי y, x ו-z בתצוגה דיגיטלית של מכשירים סטריאוטקסיים. עבור אזורי מוח ידועים, ניתן לקבל את פרמטרי הקואורדינטות הסטריאוטקסיות של אזור מסוים^{מאטלסים 4} של מוח עכבר (למשל, מוח העכבר של פקסינוס ופרנקלין בקואורדינטות סטריאוטקסיות) ו/או מהספרות שפורסמה ^5,6. עם זאת, יש צורך בתיקוף נוסף בשל שינויים בציוד סטריאוטקסי ובגיל/אוכלוסיות העכברים המשמשים חוקרים שונים.

מבנה הוא הבסיס לתפקוד. מעגלים עצביים מהווים את הבסיס לתפקודי מוח רבים, כגון פעילויות קוגניטיביות, רגש, זיכרון, תפקודים חושיים ומוטוריים¹. תיוג המבנה ומניפולציה של הפעילות של מעגלים עצביים חיוניים להבנת תפקודו של מעגל עצבי מסוים. במהלך העשורים האחרונים, עוקבים עצביים התפתחו במשך דורות רבים; מחקרים מוקדמים אימצו את נבט החיטה אגלוטינין (WGA) ופאזולוס וולגריס אגלוטינין (PHA) כעוקבים אנטרוגרדיים, ואת פלואורוגולד (FG), תת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB), קרבוציאנין כעוקבים מדרדרים. עם זאת, שלא כמו נותבים נגיפיים, עוקבים עצביים מסורתיים אלה אינם יכולים לשלב גנים אקסוגניים בפונדקאי, וגם אין להם סלקטיביות מסוג התא. כיום, האסטרטגיה הוויראלית הפכה להצעה חשובה במהלך מחקר בסיסי במדעי המוח. למטרות מחקר שונות, ניתן לבחור כלים ויראליים שונים ^7,8. ישנם וירוסים שאינם טרנססינפטיים, וירוסים טרנס-מולטיסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים), ונגיפים טרנס-מונוסינפטיים (מדרדרים ואנטרוגרדים). כל קטגוריה מכילה מספר סוגים עם מאפיינים מתאימים.

תהליך הניהול והביטוי של הנגיפים הוא עתיר זמן ומשאבים, ולעתים קרובות לוקח שבועות ואף יותר. בין וקטורים נגיפיים שונים, וירוס הקשור באדנו זוהה כאמצעי מבטיח להעברת גנים, ומספק חלון רחב הנע בין 3 ל 8 שבועות לאחר ההזרקה להליך הניסוי ^7,8. ככל ש- AAV מתפתח, ניתוח יכול להתבצע 2-3 שבועות לאחר מתן ^9,10. עוקבים אחרים של מעגלים עצביים, כגון וירוס פסאודורבי (PRV) ונגיף הכלבת (RV), דורשים גם הם תקופת מעקב של לפחות 2-7 ימים 11,12,13,14,15. לפיכך, אימות ראשוני של אתר ההזרקה לפני צפייה באותות פלואורסצנטיים הוא גם זמן וגם חסכוני.

כדי לאפשר אימות פשוט ומהיר של הזרקות סטריאוטקסיות, במחקר זה, צבע ניתן לפני וקטורים נגיפיים, והקפאה מאפשרת לחוקרים לצפות באתר ההזרקה ולעקוב אחריו תוך 30 דקות לאחר ההזרקה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) ולמדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. המחקר הנוכחי אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאוטונג בשנחאי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J בני שמונה שבועות. בעלי החיים הושגו באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים) ושוכנו בכלובים סטנדרטיים (22°C ±-2°C, 12 שעות/12 שעות מחזור אור/חושך, מזון ומים עד לליביטום).

1. בחירת אזורי מטרה במוח

הערה: זהו הליך סטרילי. ודא שכל כלי הניתוח מעוקרים. יש לרסס את הכפפות באלכוהול לפני מגע עם כלי ניתוח. הימנע מלגעת בקצה המכשירים או באזור הניתוח עם כפפות. ודא שהעכבר מורדם כראוי לפני תחילת ההליך על ידי בדיקת אובדן רפלקסים נכונים וללא תגובה לגירוי עורי. לפני הקידוח וההזרקה, עקוב מקרוב אחר קצב הנשימה (60-220 נשימות לדקה, ממוצע 100-150 נשימות לדקה) ומשרעת הנשימה (צריכה להיות עקבית ולא רדודה או עמוקה מדי). יש לציין כל שינוי משמעותי בקצב הנשימה או באמפליטודה.

1. מרדימים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal של 1.25% tribromoethanol (250 מ"ג / ק"ג) באמצעות מחט 29 גרם. יש לגלח את השיער על הגולגולת ברגע שהרפלקס הנכון נעלם. אבטח את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית (ראה טבלת חומרים) על ידי קיבוע החותכות העליונות עם מהדק אף וייצוב הראש באמצעות שני מוטות אוזניים.
2. יש למרוח משחה אופתלמית למניעת יובש בעיניים. יש לחטא את הקרקפת על ידי ספוג שלוש פעמים עם אנרדיאן (תמיסת חיטוי; ראו טבלת חומרים). הזריקו 0.2 מ"ל של לידוקאין 1% תת עורית באמצעות מחט אינסולין 29 גרם כדי לספק שיכוך כאבים מקומי.
3. בצע חתך של 0.5 ס"מ באמצעות מספריים בעין כדי לחשוף את הגולגולת. השתמש בצמר גפן טבול עם 3% H₂O₂ כדי לקרצף את הגולגולת החשופה כדי להסיר את periosteum. הניחו לגולגולת להתייבש.
4. הצמידו את המקדחה למכשיר הסטריאוטקסי. כוונן את ידיות הזרועות הסטריאוטקסיות כך שימקמו את קצה המקדחה בדיוק בברגמה בעזרת זכוכית מגדלת ורשום את ערך ציר z באמצעות צג LCD דיגיטלי.
   1. כוונן את הידיות ומקם את קצה המקדחה בלמדא ורשום את הערך של ציר z. כוונן את מהדק האף ואת מוטות האוזניים כדי לקרב שני ערכי z, וחזור על השלבים לעיל עד שההפרש בין שני ערכי z קטן מ- 0.1 מ"מ.
      הערה: צירי x, y ו-z בצג LCD דיגיטלי תואמים לצירים בינוניים (ML), אנטרופוסטריים (AP) וגב-ונטרליים (DV), בהתאמה. הברגמה והלמבדה יכולות להיחשב כנמצאות באותו מישור אופקי כאשר ההפרש בין שני ערכי z קטן מ-0.1 מ"מ.
5. ודא את רמת שמאל-ימין של המוח. התאימו את מוטות האוזניים המחוברים למסגרת הסטריאוטקסית באותו קנה מידה. קח את הגרעין tegmental laterodorsal, החלק הגחוני (LDTgV), למשל; הקואורדינטות הסטריאוטקסיות שלו הן -5.2 עבור x, +0.8 עבור y, -4.0 עבור z, על פי Paxinos ואטלס מוח העכבר של פרנקלין¹⁶.
   1. כוונן את מוט האוזן כדי לבצע את המקדחה ב- (-5.2, +0.8) כדי למדוד את ערך z בכיוון הגב-גחוני והזז את המקדחה ל- (-5.2, -0.8) כדי למדוד את ערך z.
      הערה: שמאל-ימין נחשב ברמה שווה כאשר ההפרש בין שני ערכי z קטן מ- 0.2 מ"מ. יש להחדיר את מוטות האוזניים למקום הנכון מכיוון שהבשר השמיעתי החיצוני סימטרי. אם ההפרש בין שני ערכי z הוא יותר מ-0.5 מ"מ, ייתכן שמוט האוזן יוכנס למקום הלא נכון.
6. מקם שוב את המקדחה לברגמה והגדר שלוש קואורדינטות בצג הדיגיטלי LCD לאפס. מקם את המקדחה מעל אזור העניין באמצעות קואורדינטות ייחוס. התחל את התרגיל.
   1. מנמיכים בהדרגה את המקדחה באמצעות הזרוע האנכית עד שהיא חודרת את הגולגולת. יש לפנות פסולת ודם באמצעות צמר גפן.
      הערה: היזהר שלא לפגוע ברקמת המוח.

2. הכנת תמיסת צבע ומיקרו-הזרקה למוח

1. יש ליטול 25 μL של מאגר טעינה SDS-PAGE המכיל ברומופנול כחול (ראה טבלת חומרים) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 200 μL. הוסף 50 μL של ddH₂O לצינור כדי להכין את תמיסת הצבע.
2. כסו את חלון הגולגולת בפד צמר גפן לח במי מלח. להבטיח פטנט microsyringe על ידי שאיפה וגירוש מלוחים שוב ושוב. טען 0.3 מיקרוליטר של צבע לתוך מזרק מיקרו. חבר את המזרק ואת המיקרו-מזרק הסטריאוטקסי הממונע לזרוע הסטריאוטקסית.
3. מקם את קצה המזרק בברגמה והגדר את הקואורדינטות לאפס בצג LCD דיגיטלי. להתאים את המחט לאזור העניין על פי קואורדינטות התייחסות. הגדר את מהירות ההזרקה ל -0.1 μL / min והפעל את המיקרו-מזרק הממונע, המספק 0.3 μL של צבע כחול לאזור המטרה. השאירו את המזרק במקומו לפחות 10 דקות לפני שתמשכו את המזרק באיטיות.
   הערה: ניתן להשתמש בצבעים שונים באותם עכברים כדי להבחין בין אזורים קרובים. בדוק צבעים אחרים עבור ריכוזים מתאימים בהתבסס על התכונות הפיזיות שלהם. מומלץ להשתמש בפורמולה הכחולה ברומופנול ולשטוף היטב את המזרק לפני ואחרי השימוש כדי למנוע סתימות. התאמת נפחי ההזרקה בהתבסס על דיפוזיית צבע.

3. קצירת רקמת מוח והקפאה

1. שחרר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית. להרדים את העכבר עם הזרקה intraperitoneal של 50 מ"ג / ק"ג נתרן pentobarbital באמצעות מחט 29 גרם. אבטח את העכבר על לוח קצף באמצעות סרט הדבקה.
2. פתח את שני צידי בית החזה כדי לגרום לחנק מהיר. בצע חתך של 1-2 מ"מ בתוספתן פרוזדורים ימני. הכנס מחט עירוי לחדר השמאלי. להחדיר 20 מ"ל של מלוחים מקוררים מראש ו 20 מ"ל של תמיסת 4% paraformaldehyde קר.
3. ערפו את ראשו של העכבר בעזרת מספריים לניתוח רקמות (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). הסר את העור על ידי ביצוע חתך לאורך קו האמצע מהצוואר אל האף ולאחר מכן לחשוף את הגולגולת. נקה שאריות שריר על הגולגולת עם מלקחיים או מספריים.
4. מקמו את קצה להב אחד של המספריים העדינים בין הפתח מגנום למוח, כאשר הקצה החד פונה אל העצם, בקצה הרוסטרלי של התפר האמצעי. המשך להחליק ולחתוך את הגולגולת לאורך התפר באמצע sagittal. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת, וחשפו את המוח החשוף.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מגרימת נזק למוח במהלך הניתוח. לפני הסרת שבבי העצם, לקלף בזהירות את כל קרומי המוח שעשויים להיות מחוברים לגולגולת. אמצעי זהירות זה חיוני למניעת חיתוך לא מכוון של רקמת המוח במהלך התהליך.
5. הפעל את עוצמת הקריוסטט הסיבובי של המיקרוטום (ראה טבלת חומרים) והגדר את טמפרטורת התא ל -20 מעלות צלזיוס. יוצקים מעט תרכובת OCT כדי לכסות את פני השטח של דיסק הדגימה באופן שווה. הכניסו אותו לתא ההקפאה ואפשרו ל-OCT להתמצק.
6. חבר את הדיסק לראש הדגימה. קרב את הלהב לבלוק וחתוך את בלוק OCT כדי ליצור מישור שטוח המקביל לדיסק.
7. חותכים את המוח בכיוון העטרה הרחק מאתר ההזרקה בתבנית פרוסת מוח על ידי להב גילוח. הניחו את רקמת המוח המכילה את אתר ההזרקה עם הצד החתוך כלפי מטה במישור השטוח OCT.
   1. שפכו OCT על המוח והכניסו את הדיסק לתא ההקפאה, מה שמאפשר לגוש הדגימה להתמצק. שפכו OCT שוב ושוב על המוח עד שהמוח מוטמע במלואו ב-OCT.
      הערה: הוסף את OCT מורכב שכבה אחר שכבה. לאחר שהשכבה הקודמת של OCT הוקפאה, שפכו את השכבה הבאה של תרכובת OCT על המוח.
8. חתוך את גוש הדגימה עד שאזור היעד מתקרב. בצע מספר קטעים מרמת אתר ההזרקה. אספו את פרוסות המוח העטרה לתוך צלחת בת 6 בארות המכילה PBS בטמפרטורת החדר באמצעות מברשת כתיבה קטנה הנשמרת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
   הערה: הגדר את עובי החיתוך לעובי גדול יותר כדי לחתוך את הבלוק, ולאחר מכן הגדר את עובי החיתוך ל- 40 מיקרומטר כאשר הלהב מתקרב לאתר ההזרקה. אם משתמשים בעוקבים אחר מעגלים עצביים, העכברים אינם מוקרבים מיד. הניחו את העכבר בכלוב התאוששות סטרילי לאחר הניתוח מעל שמיכת חימום לצורך התאוששות מהרדמה. החזירו את העכברים לכלוב המקורי או לכלוב חדש ברגע שיתעוררו.

4. הדמיה

1. שטפו את ה-OCT עם PBS בטמפרטורת החדר. השתמשו במברשת כדי לאסוף אזורים במוח ולמקם אותם על שקופית. הניחו לחלקים להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
2. התבונן באזור המוזרק באופן חזותי או השתמש במיקרוסקופ כאשר גרעיני המטרה זעירים. השווה את מיקום הצבע המוזרק לאזור המתאים באטלס המוח.
   הערה: התאם את הערכים של צירי x, y ו- z בהתאם לכיוון ולמרחק של סטיית נקודת ההזרקה. ייתכן שיהיה צורך לחזור על כל השלבים בפרוטוקול זה מספר פעמים כדי לקבוע את הקואורדינטות במדויק.

תוצאות

מחקר זה זיהה בהצלחה את אתר ההזרקה תוך 30 דקות באמצעות השיטה שהודגמה. בתחילה, תמיסת טעינת דגימות SDS-PAGE המכילה ברומופנול כחול הוזרק לתוך LDTgV בעכברי C57/BL. איור 1A מראה ייצוג סכמטי של הזרקת תמיסת הצבע. התפלגות הצבע הכחול ב-LDTgV מודגמת באיור 1B.

ברומופנול...

Discussion

מאמר זה תיאר אסטרטגיה יציבה לאימות הדיוק של זריקות מוח סטריאוטקסיות ^5,6 מהר יותר ופשוט לפני מעקב נגיפי, אך ההיבט חסר התחליף של ביטוי גנים מדווח באזור המוח הוא חיוני לתיוג אזור המוח. הצבע הכחול בו השתמשנו איפשר הדמיה מיידית של אתר ההזרקה.

מספר ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910