Предварительная валидация стереотаксических координат инжекции с помощью криосекции

Резюме

В настоящем протоколе описана практическая стратегия для ускорения этапа верификации координат стереотаксической инъекции перед проведением отслеживания вируса с использованием красителей и замороженных срезов.

Аннотация

Стереотаксическая инъекция в определенную область мозга представляет собой фундаментальный экспериментальный метод в фундаментальной нейробиологии. Исследователи обычно основывают свой выбор параметров стереотаксической инъекции на атласах мозга мышей или опубликованных материалах, в которых использовались различные популяции/возрасты мышей и различное стереотаксическое оборудование, что требует дальнейшей проверки параметров стереотаксических координат. Эффективность визуализации кальция, хемогенетических и оптогенетических манипуляций зависит от точной экспрессии репортерных генов в исследуемой области, что часто требует нескольких недель усилий. Таким образом, это трудоемкая задача, если заранее не проверены координаты целевой области мозга. Используя соответствующий краситель вместо вируса и реализуя криосекцию, исследователи могут наблюдать за местом инъекции сразу после введения красителя. Это способствует своевременной корректировке параметров координат в тех случаях, когда существуют расхождения между фактическим местом введения и теоретическим положением. Такие корректировки значительно повышают точность экспрессии вируса в целевой области в последующих экспериментах.

Введение

Почти все современные инструменты нейромодуляции, включая запись кальция in vivo, оптогенетические и хемогенетические инструменты, требуют использования стереотаксических координат для нацеливания на область мозга, представляющую интерес ^1,2,3, что составляет основу нейронных манипуляций. Стереотаксические координаты областей мозга мыши определяются по отношению к брегме и лямбде, костным ориентирам на черепе, образуя так называемую стереотаксическую систему координат, производную от черепа. Либо брегма, либо лямбда могут служить нулевой точкой трехмерных координат. Три оси — переднезадняя (AP), медиолатеральная (ML) и дорсовентральная (DV), представляющие оси y, x и z на цифровом дисплее стереотаксических инструментов. Для хорошо известных областей мозга параметры стереотаксических координат конкретной области могут быть получены из атласов мозга мышей⁴ (например, мозг мыши Паксиноса и Франклина в стереотаксических координатах) и/или из опубликованной литературы ^5,6. Тем не менее, дальнейшая валидация необходима из-за различий в стереотаксическом оборудовании и возрасте/популяциях мышей, используемых различными исследователями.

Структура – это основа функции. Нейронные цепи формируют основу для многих функций мозга, таких как когнитивная деятельность, эмоции, память, сенсорные и моторные^{функции.} Маркировка структуры и манипулирование активностью нейронных цепей жизненно важны для понимания функции конкретной нейронной цепи. За последние десятилетия нейронные индикаторы развивались на протяжении многих поколений; в ранних исследованиях в качестве антероградных индикаторов использовались агглютинин зародышей пшеницы (WGA) и агглютинин phaseolus vulgaris (PHA), а в качестве ретроградных индикаторов - фторзолото (FG), субъединица холерного токсина B (CTB), карбоцианин. Однако, в отличие от вирусных индикаторов, эти традиционные нейронные индикаторы не могут интегрировать экзогенные гены в организм хозяина, а также не обладают селективностью по типу клеток. В настоящее время вирусная стратегия стала важным предложением в фундаментальных исследованиях в области нейробиологии. Для различных исследовательских целей могут быть выбраны различные вирусные средства ^7,8. Различают нетранссинаптические вирусы, транс-мультисинаптические вирусы (ретроградные и антероградные) и транс-моносинаптические вирусы (ретроградные и антероградные). Каждая категория содержит несколько типов с соответствующими характеристиками.

Процесс введения и экспрессии вируса очень трудоемкий и ресурсоемкий, часто занимает недели или даже дольше. Среди различных вирусных векторов аденоассоциированный вирус был идентифицирован как перспективное средство доставки генов, обеспечивающее широкое окно в диапазоне от 3 до 8 недель после инъекции для экспериментальной процедуры ^7,8. По мере развития AAV анализ может быть проведен через 2-3 недели после введения ^9,10. Другие индикаторы нейронных цепей, такие как вирус псевдобешенства (PRV) и вирус бешенства (RV), также требуют периода отслеживания не менее 2-7 дней 11,12,13,14,15. Таким образом, предварительная верификация места инъекции перед наблюдением сигналов флуоресценции является как быстрой, так и экономически эффективной.

Чтобы облегчить простую и быструю верификацию стереотаксических инъекций, в этом исследовании краситель вводится перед вирусными векторами, а криосекция позволяет исследователям наблюдать за местом инъекции и отслеживать его в течение 30 минут после инъекции.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) и Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Настоящее исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными и их использованию больницы Жэньцзи Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун. Для настоящего исследования были использованы восьминедельные самцы мышей C57BL/6J. Животные были коммерчески получены (см. Таблицу материалов) и содержались в стандартных клетках (22 °C ± 2 °C, 12 ч/12 ч светлый/темный цикл, пища и вода ad libitum).

1. Выбор целевых областей мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Это стерильная процедура. Убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы. Опрыскайте перчатки спиртом перед контактом с хирургическими инструментами. Не прикасайтесь в перчатках к кончикам инструментов или к области операции. Перед началом процедуры убедитесь, что мышь надлежащим образом обезболивается, проверив потерю корректирующих рефлексов и отсутствие реакции на стимуляцию кожи. Перед сверлением и инъекцией внимательно следите за частотой дыхания (60-220 вдохов в минуту, в среднем 100-150 вдохов в минуту) и амплитудой дыхания (она должна быть постоянной и не должна быть чрезмерно поверхностной или глубокой). Следует отметить любые значительные изменения частоты дыхания или амплитуды.

1. Обезболивайте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции 1,25% трибромэтанола (250 мг/кг) с помощью иглы 29 G. Сбрейте волосы на черепе, как только исчезнет корректирующий рефлекс. Закрепите мышь в стереотаксической раме (см. Таблицу материалов), зафиксировав верхние резцы носовым зажимом и стабилизировав голову с помощью двух ушных планок.
2. Применяйте офтальмологическую мазь для профилактики сухости глаз. Продезинфицируйте кожу головы, трижды протерев ее анердианом (дезинфицирующим раствором; см. Таблицу материалов). Введите 0,2 мл 1% лидокаина подкожно с помощью инсулиновой иглы 29 г для обеспечения местной анальгезии.
3. Сделайте разрез 0,5 см с помощью глазных ножниц, чтобы обнажить черепную коробку. Используйте ватный тампон, смоченный в 3%_H2O₂ , чтобы потереть открытый череп, чтобы удалить надкостницу. Дайте черепной коробке высохнуть.
4. Прикрепите дрель к стереотаксическому инструменту. С помощью лупы отрегулируйте ручки стереотаксических рычагов так, чтобы наконечник сверла находился точно на брегме, и запишите значение оси Z с помощью цифрового ЖК-дисплея.
   1. Отрегулируйте ручки и расположите наконечник сверла на лямбде и запишите значение оси z. Отрегулируйте носовой зажим и ушные планки, чтобы сделать два z-значения ближе, и повторяйте описанные выше шаги, пока разница между двумя z-значениями не станет менее 0,1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оси x, y и z на цифровом ЖК-дисплее соответствуют медиолатеральной (ML), переднезадней (AP) и дорсовентральной (DV) соответственно. Брегма и лямбда могут рассматриваться как находящиеся в одной горизонтальной плоскости, если разница между двумя z-значениями составляет менее 0,1 мм.
5. Обеспечьте лево-правый уровень мозга. Отрегулируйте амбушюры, прикрепленные к стереотаксической раме, с той же шкалой. Возьмем, к примеру, латеродорсальное тегментальное ядро, вентральную часть (LDTgV); его стереотаксические координаты равны -5,2 для x, +0,8 для y, -4,0 для z, согласно атласу мозга мыши Paxinos and Franklin's¹⁶.
   1. Отрегулируйте ушную планку, чтобы сверло находилось в положении (-5,2, +0,8), чтобы измерить значение z в дорсально-вентральном направлении, и переместите сверло в положение (-5,2, -0,8), чтобы измерить значение z.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Левый-правый считается равным, когда разница между двумя z-значениями составляет менее 0,2 мм. Ушные планки должны быть вставлены в нужное место, потому что наружный слуховой проход симметричен. Если разница между двумя z-значениями составляет более 0,5 мм, ушная планка может быть вставлена не в то место.
6. Снова установите дрель на брегму и установите три координаты на цифровом ЖК-дисплее равными нулю. Расположите сверло над областью интереса, используя опорные координаты. Начните бурение.
   1. Постепенно опускайте сверло с помощью вертикального рычага, пока оно не проникнет в черепную коробку. Удалите мусор и кровь с помощью ватных палочек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани мозга.

2. Приготовление раствора красителя и микроинъекция в мозг

1. Возьмите 25 мкл загрузочного буфера SDS-PAGE, содержащего бромфенольный синий (см. Таблицу материалов) в микроцентрифужную пробирку объемом 200 мкл. Добавьте в пробирку 50 мкл ddH₂O для приготовления раствора красителя.
2. Накройте черепное окно ватным диском, смоченным в физрастворе. Обеспечьте проходимость микрошприца путем многократной аспирации и вытеснения физиологического раствора. Загрузите 0,3 мкл красителя в микрошприц. Прикрепите шприц и моторизованный стереотаксический микроинъектор к стереотаксическому кронштейну.
3. Расположите наконечник шприца на брегме и установите координаты на ноль на цифровом ЖК-дисплее. Отрегулируйте иглу в интересующей области в соответствии с опорными координатами. Установите скорость впрыска на 0,1 μл/мин и запустите моторизованный микроинъектор, подающий 0,3 μL синего красителя в целевую область. Оставьте шприц в нужном положении не менее чем на 10 минут, прежде чем медленно извлекать инжектор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На одних и тех же мышах можно использовать красители разных цветов для различения близко расположенных областей. Проверьте другие красители на подходящие концентрации в зависимости от их физических свойств. Рекомендуется использовать формулу бромофенолового синего и тщательно промывать шприц до и после использования, чтобы предотвратить закупорку. Регулируйте объемы инъекций в зависимости от диффузии красителя.

3. Забор ткани головного мозга и криосекция

1. Освободите мышь от стереотаксической рамки. Обезболивайте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции 50 мг/кг пентобарбитала натрия с помощью иглы 29 G. Закрепите мышь на поролоновой доске с помощью скотча.
2. Вскрыть обе стороны грудной клетки, чтобы вызвать быстрое удушье. Сделайте разрез 1-2 мм в придатке правого предсердия. Введите инфузионную иглу в левый желудочек. Влейте 20 мл предварительно охлажденного физиологического раствора и 20 мл 4% раствора параформальдегида со льдом.
3. Обезглавьте мышь ножницами для рассечения тканей (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Снимите кожу, сделав разрез по средней линии от шеи к носу, а затем обнажите череп. Удалите остатки мышц на черепе с помощью щипцов или ножниц.
4. Расположите кончик одного лезвия тонких ножниц между большим затылочным отверстием и мозгом, острым краем к кости, на ростральном конце среднего сагиттального шва. Приступайте к скольжению и разрезу черепной коробки по среднесагиттальному шву. С помощью щипцов удалите череп, обнажив обнаженный мозг.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не нанести вред мозгу во время операции. Перед удалением костной стружки осторожно снимите все мозговые оболочки, которые могут быть прикреплены к черепу. Эта мера предосторожности имеет решающее значение для предотвращения непреднамеренного разрезания мозговой ткани во время процесса.
5. Включите питание ротационного микротомного криостата (см. Таблицу материалов) и установите температуру камеры на -20 °C. Налейте немного ОКТ-состава, чтобы равномерно покрыть поверхность диска образца. Поместите его в криокамеру и дайте ОКТ застыть.
6. Прикрепите диск к головке образца. Поднесите лезвие ближе к блоку и обрежьте блок OCT, чтобы получилась плоская плоскость, параллельная диску.
7. Разрежьте мозг в корональном направлении от места инъекции в форме для среза мозга с помощью бритвенного лезвия. Поместите мозговую ткань, содержащую место инъекции, стороной разреза вниз на плоскую плоскость ОКТ.
   1. Налейте ОКТ на мозг и поместите диск в криокамеру, позволив блоку образца затвердеть. Многократно вводите ОКТ в мозг до тех пор, пока мозг полностью не будет внедрен в ОКТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте ОКТ-соединение слой за слоем. Как только предыдущий слой ОКТ будет заморожен, влейте следующий слой соединения ОКТ в мозг.
8. Обрезайте блок образца до тех пор, пока не приблизится целевая область. Сделайте несколько секций от уровня места инъекции. Соберите срезы коронального мозга в 6-луночный планшет, содержащий PBS комнатной температуры, с помощью маленькой кисти для письма, поддерживаемой при температуре -20 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установите большую толщину резки, чтобы обрезать блок, а затем установите толщину резки на 40 мкм, когда лезвие приближается к месту впрыска. Если используются трассировщики нейронных цепей, мыши не приносятся в жертву сразу. Поместите мышь в стерильную клетку для послеоперационного восстановления поверх нагревательного одеяла для восстановления после анестезии. Верните мышей в исходную клетку или в новую клетку после пробуждения.

4. Визуализация

1. Промойте ОКТ комнатной температурой PBS. С помощью кисти возьмите участки мозга и поместите их на предметное стекло. Дайте секциям высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
2. Наблюдайте за вводимой областью визуально или используйте микроскоп, когда ядра мишени мельчайшие. Сравните расположение введенного красителя с соответствующей областью в атласе мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте значения осей x, y и z в соответствии с направлением и расстоянием отклонения точки впрыска. Может потребоваться повторить все шаги в этом протоколе несколько раз для точного определения координат.

Результаты

В этом исследовании было успешно идентифицировано место инъекции в течение 30 мин с использованием продемонстрированного метода. Первоначально раствор для загрузки образцов SDS-PAGE, содержащий бромфенольный синий, вводили в LDTgV мышам C57/BL. На рисунке 1А показано схематичес...

Обсуждение

В этой статье описана стабильная стратегия более быстрой и простой проверки точности стереотаксических инъекций в мозг до отслеживания вируса, но незаменимый аспект экспрессии репортерных генов в области мозга имеет решающее значение для маркировки областей мозга.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910