Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine praktische Strategie, um den Verifizierungsschritt stereotaktischer Injektionskoordinaten zu beschleunigen, bevor die Virusverfolgung mit Farbstoffen und Gefrierschnitten durchgeführt wird.

Zusammenfassung

Die stereotaktische Injektion einer bestimmten Hirnregion stellt eine grundlegende experimentelle Technik in den Neurowissenschaften dar. Forscher stützen sich bei der Wahl der stereotaktischen Injektionsparameter häufig auf Hirnatlanten von Mäusen oder veröffentlichten Materialien, die verschiedene Populationen/Altersgruppen von Mäusen und unterschiedliche stereotaktische Geräte verwendeten, was eine weitere Validierung der stereotaktischen Koordinatenparameter erforderlich machte. Die Wirksamkeit von Calcium-Bildgebung, chemogenetischen und optogenetischen Manipulationen beruht auf der präzisen Expression von Reportergenen innerhalb der interessierenden Region, die oft mehrere Wochen Aufwand erfordert. Daher ist es eine zeitaufwändige Aufgabe, wenn die Koordinaten der Zielhirnregion nicht im Voraus verifiziert werden. Mit einem geeigneten Farbstoff anstelle eines Virus und der Durchführung von Kryosektionen können die Forscher die Injektionsstelle unmittelbar nach der Farbstoffverabreichung beobachten. Dies ermöglicht eine rechtzeitige Anpassung der Koordinationsparameter in Fällen, in denen Diskrepanzen zwischen der tatsächlichen Injektionsstelle und der theoretischen Position bestehen. Solche Anpassungen verbessern die Genauigkeit der viralen Expression innerhalb der Zielregion in nachfolgenden Experimenten erheblich.

Einleitung

Nahezu alle modernen Neuromodulationswerkzeuge, einschließlich der In-vivo-Kalziumaufzeichnung, optogenetischer und chemogenetischer Werkzeuge, erfordern die Verwendung stereotaktischer Koordinaten, um den interessierenden Hirnbereich zu erreichen ^1,2,3, was die Grundlage der neuronalen Manipulation bildet. Stereotaktische Koordinaten für Hirnregionen von Mäusen werden in Beziehung zu Bregma und Lambda, den knöchernen Landmarken auf dem Schädel, definiert, die das sogenannte skull-derived stereotaxic coordinate system bilden. Als Nullpunkt der dreidimensionalen Koordinaten kann entweder Bregma oder Lambda dienen. Die drei Achsen sind anteroposterior (AP), mediolateral (ML) und dorsoventral (DV) und stellen die y-, x- und z-Achsen auf der digitalen Anzeige stereotaktischer Instrumente dar. Für bekannte Hirnregionen können die stereotaktischen Koordinatenparameter eines bestimmten Bereichs aus Maushirnatlanten⁴ (z.B. Paxinos und Franklins Mausgehirn in stereotaktischen Koordinaten) und/oder der veröffentlichten Literatur ^5,6 gewonnen werden. Eine weitere Validierung ist jedoch aufgrund von Unterschieden in der stereotaktischen Ausrüstung und dem Alter/der Populationen von Mäusen, die von verschiedenen Forschern verwendet werden, erforderlich.

Struktur ist die Basis der Funktion. Neuronale Schaltkreise bilden die Grundlage für viele Gehirnfunktionen, wie z. B. kognitive Aktivitäten, Emotionen, Gedächtnis, sensorische und motorische Funktionen¹. Die Markierung der Struktur und die Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise sind entscheidend für das Verständnis der Funktion eines bestimmten neuronalen Schaltkreises. In den letzten Jahrzehnten haben sich neuronale Tracer über viele Generationen hinweg entwickelt; Frühe Forschungen verwendeten Weizenkeimaggglutinin (WGA) und Phaseolus vulgaris Agglutinin (PHA) als anterograde Tracer und Fluorgold (FG), Choleratoxin-Untereinheit B (CTB) und Carbocyanin als retrograde Tracer. Im Gegensatz zu viralen Tracern können diese herkömmlichen neuronalen Tracer jedoch keine exogenen Gene in den Wirt integrieren und weisen auch keine Zelltypselektivität auf. Heutzutage ist die virale Strategie zu einem wichtigen Vorschlag in der neurowissenschaftlichen Grundlagenforschung geworden. Für unterschiedliche Forschungszwecke können verschiedene virale Werkzeuge ausgewählt werden ^7,8. Es gibt nicht-transsynaptische Viren, trans-multisynaptische Viren (retrograd und anterograde) und trans-monosynaptische Viren (retrograd und anterograd). Jede Kategorie enthält mehrere Typen mit entsprechenden Merkmalen.

Der Prozess der viralen Verabreichung und Expression ist sehr zeit- und ressourcenintensiv und dauert oft Wochen oder sogar länger. Unter den verschiedenen viralen Vektoren wurde das Adeno-assoziierte Virus als vielversprechendes Mittel für die Genübertragung identifiziert, das ein breites Zeitfenster von 3 bis 8 Wochen nach der Injektion für das experimentelle Verfahren bietet ^7,8. Mit fortschreitender AAV kann die Analyse 2-3 Wochen nach der Verabreichung durchgeführt werden ^9,10. Andere Tracer für neuronale Schaltkreise, wie z. B. das Pseudotollwutvirus (PRV) und das Tollwutvirus (RV), erfordern ebenfalls einen Rückverfolgungszeitraum von mindestens 2-7 Tagen 11,12,13,14,15. Daher ist eine vorläufige Überprüfung der Injektionsstelle vor der Beobachtung von Fluoreszenzsignalen sowohl zeit- als auch kosteneffizient.

Um eine einfache und schnelle Überprüfung von stereotaktischen Injektionen zu ermöglichen, wird in dieser Studie ein Farbstoff vor viralen Vektoren verabreicht, und die Kryosektion ermöglicht es den Forschern, die Injektionsstelle zu beobachten und innerhalb von 30 Minuten nach der Injektion zu verfolgen.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche (Animal Research Reporting In Vivo Experiments, ARRIVE) und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die vorliegende Studie wurde vom Animal Care and Use Committee des Renji Hospital der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte männliche Mäuse des Typs C57BL/6J verwendet. Die Tiere wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und in Standardkäfigen untergebracht (22 °C ± 2 °C, 12 h/12 h Hell-/Dunkelgang, Futter und Wasser ad libitum).

1. Auswahl der Zielregionen des Gehirns

HINWEIS: Dies ist ein steriles Verfahren. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert sind. Sprühen Sie die Handschuhe vor dem Kontakt mit chirurgischen Instrumenten mit Alkohol ein. Vermeiden Sie es, die Spitze der Instrumente oder den Operationsbereich mit Handschuhen zu berühren. Stellen Sie sicher, dass die Maus vor Beginn des Eingriffs ausreichend betäubt ist, indem Sie auf den Verlust der Aufrichtreflexe und keine Reaktion auf die kutane Stimulation prüfen. Überwachen Sie vor dem Bohren und Injizieren genau die Atemfrequenz (60-220 Atemzüge pro Minute, durchschnittlich 100-150 Atemzüge pro Minute) und die Atemamplitude (sollte gleichmäßig und nicht zu flach oder tief sein). Signifikante Veränderungen der Atemfrequenz oder -amplitude sollten vermerkt werden.

1. Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 1,25 % Tribromethanol (250 mg/kg) mit einer 29-g-Nadel. Rasieren Sie die Haare am Schädel, sobald der Aufrichtreflex verschwunden ist. Sichern Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle), indem Sie die oberen Schneidezähne mit einer Nasenklemme fixieren und den Kopf mit zwei Ohrstangen stabilisieren.
2. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um Augentrockenheit zu verhindern. Desinfizieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie dreimal mit Anerdian (Desinfektionslösung; siehe Materialtabelle) abtupfen. Injizieren Sie 0,2 ml 1% Lidocain subkutan mit einer 29-g-Insulinnadel, um eine lokale Analgesie zu verabreichen.
3. Machen Sie mit einer Augenschere einen 0,5 cm langen Schnitt, um den Schädel freizulegen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, das in 3% H₂O₂ getaucht ist, um den freiliegenden Schädel zu schrubben und das Periost zu entfernen. Lassen Sie den Schädel trocknen.
4. Befestigen Sie den Bohrer am stereotaktischen Instrument. Stellen Sie die Drehknöpfe der stereotaktischen Arme ein, um die Bohrerspitze mit Hilfe einer Lupe präzise am Bregma zu positionieren und den Wert der z-Achse über die LCD-Digitalanzeige aufzuzeichnen.
   1. Stellen Sie die Knöpfe ein, positionieren Sie die Bohrspitze am Lambda und notieren Sie den Wert der z-Achse. Stellen Sie die Nasenklemme und die Ohrbügel so ein, dass sich zwei Z-Werte annähern, und wiederholen Sie die obigen Schritte, bis die Differenz zwischen den beiden Z-Werten weniger als 0,1 mm beträgt.
      HINWEIS: Die x-, y- und z-Achsen auf der LCD-Digitalanzeige entsprechen der mediolateralen (ML), der anteroposterioren (AP) bzw. der dorsoventralen (DV). Bregma und Lambda können als auf derselben horizontalen Ebene liegend betrachtet werden, sobald die Differenz zwischen den beiden Z-Werten weniger als 0,1 mm beträgt.
5. Stellen Sie sicher, dass die Links-Rechts-Ebene des Gehirns gewährleistet ist. Passen Sie die am stereotaktischen Rahmen befestigten Ohrbügel mit der gleichen Skala an. Nehmen wir zum Beispiel den laterodorsalen tegmentalen Kern, ventralen Teil (LDTgV); Seine stereotaktischen Koordinaten sind -5,2 für x, +0,8 für y, -4,0 für z, laut Paxinos und Franklins Mausgehirnatlas¹⁶.
   1. Stellen Sie die Ohrstange so ein, dass der Bohrer auf (-5,2, +0,8) eingestellt wird, um den z-Wert in dorsal-ventraler Richtung zu messen, und bewegen Sie den Bohrer auf (-5,2, -0,8), um den z-Wert zu messen.
      HINWEIS: Links-Rechts wird als gleich angesehen, wenn die Differenz zwischen den beiden Z-Werten weniger als 0,2 mm beträgt. Die Ohrbügel müssen an der richtigen Stelle eingesetzt werden, da der äußere Gehörgang symmetrisch ist. Wenn die Differenz zwischen den beiden Z-Werten mehr als 0,5 mm beträgt, kann es sein, dass die Ohrstange an der falschen Stelle eingesetzt wurde.
6. Positionieren Sie den Bohrer wieder auf dem Bregma und stellen Sie drei Koordinaten auf der LCD-Digitalanzeige auf Null. Positionieren Sie den Bohrer mithilfe von Referenzkoordinaten über dem Interessenbereich. Starten Sie die Übung.
   1. Senken Sie den Bohrer mit dem vertikalen Arm allmählich ab, bis er in den Schädel eindringt. Entfernen Sie Schmutz und Blut mit Wattestäbchen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Hirngewebe nicht zu beschädigen.

2. Vorbereitung der Farbstofflösung und der Mikroinjektion des Gehirns

1. 25 μl SDS-PAGE-Ladepuffer mit Bromphenolblau (siehe Materialtabelle) in ein 200 μl Mikrozentrifugenröhrchen geben. 50 μl ddH₂O in das Röhrchen geben, um die Farbstofflösung herzustellen.
2. Decken Sie das Schädelfenster mit einem mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattepad ab. Stellen Sie die Durchgängigkeit der Mikrospritze sicher, indem Sie Kochsalzlösung wiederholt aspirieren und ausstoßen. Laden Sie 0,3 μl Farbstoff in die Mikrospritze. Befestigen Sie die Spritze und den motorisierten stereotaktischen Mikroinjektor am stereotaktischen Arm.
3. Positionieren Sie die Spritzenspitze am Bregma und stellen Sie die Koordinaten auf der LCD-Digitalanzeige auf Null. Passen Sie die Nadel entsprechend den Referenzkoordinaten an den interessierenden Bereich an. Stellen Sie die Injektionsgeschwindigkeit auf 0,1 μl/min ein und starten Sie den motorisierten Mikroinjektor, der 0,3 μl blauen Farbstoff in den Zielbereich abgibt. Lassen Sie die Spritze mindestens 10 Minuten lang in Position, bevor Sie den Injektor langsam herausziehen.
   HINWEIS: Unterschiedliche Farbstoffe können bei denselben Mäusen verwendet werden, um nahe beieinander liegende Regionen zu unterscheiden. Testen Sie andere Farbstoffe auf geeignete Konzentrationen basierend auf ihren physikalischen Eigenschaften. Es wird empfohlen, die Bromphenolblau-Formel zu verwenden und die Spritze vor und nach dem Gebrauch gründlich auszuspülen, um Verstopfungen zu vermeiden. Passen Sie das Injektionsvolumen basierend auf der Farbstoffdiffusion an.

3. Entnahme von Hirngewebe und Kryosektion

1. Lassen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen los. Betäuben Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 50 mg/kg Pentobarbital-Natrium mit einer 29-g-Nadel. Befestigen Sie die Maus mit Klebeband auf einer Schaumstoffplatte.
2. Öffnen Sie beide Seiten des Thorax, um eine schnelle Erstickung herbeizuführen. Machen Sie einen 1-2 mm Schnitt im rechten Vorhofohr. Führen Sie eine Infusionsnadel in die linke Herzkammer ein. 20 mL vorgekühlte Kochsalzlösung und 20 mL eisgekühlte 4%ige Paraformaldehyd-Lösung aufgießen.
3. Enthaupten Sie die Maus mit einer Gewebepräparierschere (nach institutionell anerkannten Protokollen). Entferne die Haut, indem du einen Schnitt entlang der Mittellinie vom Hals bis zur Nase machst und dann den Schädel freilegst. Beseitigen Sie Muskelreste am Schädel mit einer Zange oder Schere.
4. Positionieren Sie die Spitze einer Klinge der feinen Schere zwischen dem Foramen magnum und dem Gehirn, wobei die scharfe Kante zum Knochen zeigt, am rostralen Ende der mittleren sagittalen Naht. Fahren Sie mit dem Gleiten fort und schneiden Sie den Schädel entlang der mittleren sagittalen Naht. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schädel zu entfernen und das freiliegende Gehirn freizulegen.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um während der Operation keine Schäden am Gehirn zu verursachen. Bevor Sie die Knochenspäne entfernen, ziehen Sie vorsichtig alle Hirnhäute ab, die möglicherweise am Schädel haften. Diese Vorsichtsmaßnahme ist entscheidend, um ein versehentliches Schneiden des Hirngewebes während des Prozesses zu verhindern.
5. Schalten Sie den rotierenden Mikrotom-Kryostaten ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie die Kammertemperatur auf -20 °C ein. Gießen Sie etwas OCT-Masse, um die Oberfläche der Probenscheibe gleichmäßig zu bedecken. Legen Sie es in die Kryokammer und lassen Sie das OCT erstarren.
6. Befestigen Sie die Scheibe am Probenkopf. Bringen Sie die Klinge näher an den Block heran und schneiden Sie den OCT-Block ab, um eine flache Ebene zu erzeugen, die parallel zur Scheibe verläuft.
7. Schneiden Sie das Gehirn in koronaler Richtung von der Injektionsstelle weg in einer Gehirnschnittform mit einer Rasierklinge. Platzieren Sie das Hirngewebe, das die Injektionsstelle enthält, mit der Schnittseite nach unten auf der flachen OCT-Ebene.
   1. Gießen Sie OCT auf das Gehirn und legen Sie die Scheibe in die Kryokammer, damit sich der Probenblock verfestigen kann. Gießen Sie OCT wiederholt auf das Gehirn, bis das Gehirn vollständig in OCT eingebettet ist.
      HINWEIS: Fügen Sie die OCT-Verbindung Schicht für Schicht hinzu. Sobald die vorherige OCT-Schicht eingefroren ist, gießen Sie die nachfolgende Schicht der OCT-Verbindung auf das Gehirn.
8. Trimmen Sie den Probenblock, bis sich der Zielbereich nähert. Machen Sie mehrere Schnitte von der Ebene der Injektionsstelle. Sammeln Sie die koronalen Hirnschnitte mit einer kleinen Schreibbürste, die bei -20 °C aufbewahrt wird, in eine 6-Well-Platte mit raumwarmem PBS.
   HINWEIS: Stellen Sie die Schnittstärke auf eine größere ein, um den Block zu trimmen, und stellen Sie dann die Schnittstärke auf 40 μm ein, wenn sich die Klinge der Injektionsstelle nähert. Wenn Tracer für neuronale Schaltkreise verwendet werden, werden die Mäuse nicht sofort getötet. Legen Sie die Maus in einen sterilen, postoperativen Erholungskäfig über einer Heizdecke, um sich von der Narkose zu erholen. Setzen Sie die Mäuse wieder in den ursprünglichen Käfig oder in einen neuen Käfig zurück, sobald sie wach sind.

4. Bildgebung

1. Waschen Sie das OCT mit PBS bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Pinsel, um Gehirnabschnitte aufzunehmen und auf einer Folie zu platzieren. Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur an der Luft trocknen.
2. Beobachten Sie den injizierten Bereich visuell oder verwenden Sie ein Mikroskop, wenn die Zielkerne winzig klein sind. Vergleichen Sie die Position des injizierten Farbstoffs mit der entsprechenden Region im Gehirnatlas.
   HINWEIS: Passen Sie die Werte der x-, y- und z-Achse entsprechend der Richtung und dem Abstand der Abweichung des Anspritzpunkts an. Es kann erforderlich sein, alle Schritte in diesem Protokoll mehrmals zu wiederholen, um die Koordinaten genau zu bestimmen.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde die Injektionsstelle innerhalb von 30 Minuten mit der demonstrierten Methode erfolgreich identifiziert. Zunächst wurde eine SDS-PAGE-Probenladelösung, die Bromphenolblau enthielt, in das LDTgV in den C57/BL-Mäusen injiziert. Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung der Injektion der Farbstofflösung. Die Verteilung des blauen Farbstoffs im LDTgV ist in Abbildung 1B dargestellt.

Bromphenolblau wurde au...

Diskussion

In diesem Artikel wurde eine stabile Strategie beschrieben, um die Genauigkeit von stereotaktischen Hirninjektionen ^5,6 schneller und einfacher vor der Virusverfolgung zu überprüfen, aber der unersetzliche Aspekt der Reportergenexpression in der Gehirnregion ist entscheidend für die Markierung von Hirnregionen. Der von uns verwendete blaue Farbstoff ermöglichte die unmittelbare Visualisierung der Injektionsstelle.

Mehrere kritische...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910