Vorläufige Validierung von stereotaktischen Injektionskoordinaten mittels Kryosektion

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine praktische Strategie, um den Verifizierungsschritt stereotaktischer Injektionskoordinaten zu beschleunigen, bevor die Virusverfolgung mit Farbstoffen und Gefrierschnitten durchgeführt wird.

Zusammenfassung

Die stereotaktische Injektion einer bestimmten Hirnregion stellt eine grundlegende experimentelle Technik in den Neurowissenschaften dar. Forscher stützen sich bei der Wahl der stereotaktischen Injektionsparameter häufig auf Hirnatlanten von Mäusen oder veröffentlichten Materialien, die verschiedene Populationen/Altersgruppen von Mäusen und unterschiedliche stereotaktische Geräte verwendeten, was eine weitere Validierung der stereotaktischen Koordinatenparameter erforderlich machte. Die Wirksamkeit von Calcium-Bildgebung, chemogenetischen und optogenetischen Manipulationen beruht auf der präzisen Expression von Reportergenen innerhalb der interessierenden Region, die oft mehrere Wochen Aufwand erfordert. Daher ist es eine zeitaufwändige Aufgabe, wenn die Koordinaten der Zielhirnregion nicht im Voraus verifiziert werden. Mit einem geeigneten Farbstoff anstelle eines Virus und der Durchführung von Kryosektionen können die Forscher die Injektionsstelle unmittelbar nach der Farbstoffverabreichung beobachten. Dies ermöglicht eine rechtzeitige Anpassung der Koordinationsparameter in Fällen, in denen Diskrepanzen zwischen der tatsächlichen Injektionsstelle und der theoretischen Position bestehen. Solche Anpassungen verbessern die Genauigkeit der viralen Expression innerhalb der Zielregion in nachfolgenden Experimenten erheblich.

Einleitung

Nahezu alle modernen Neuromodulationswerkzeuge, einschließlich der In-vivo-Kalziumaufzeichnung, optogenetischer und chemogenetischer Werkzeuge, erfordern die Verwendung stereotaktischer Koordinaten, um den interessierenden Hirnbereich zu erreichen ^1,2,3, was die Grundlage der neuronalen Manipulation bildet. Stereotaktische Koordinaten für Hirnregionen von Mäusen werden in Beziehung zu Bregma und Lambda, den knöchernen Landmarken auf dem Schädel, definiert, die das sogenannte skull-derived stereotaxic coordinate system bilden. Als Nullpunkt der dreidimensionalen Koord....

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für Tierversuche (Animal Research Reporting In Vivo Experiments, ARRIVE) und dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Die vorliegende Studie wurde vom Animal Care and Use Committee des Renji Hospital der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte männliche Mäuse des Typs C57BL/6J verwendet. Die Tiere wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) und in Standardkäfigen untergebracht (22 °C ± 2 °C, 12 h/12 h Hell-/Dunkelgang, Futter und Wasser ad libitu....

Diskussion

In diesem Artikel wurde eine stabile Strategie beschrieben, um die Genauigkeit von stereotaktischen Hirninjektionen ^5,6 schneller und einfacher vor der Virusverfolgung zu überprüfen, aber der unersetzliche Aspekt der Reportergenexpression in der Gehirnregion ist entscheidend für die Markierung von Hirnregionen. Der von uns verwendete blaue Farbstoff ermöglichte die unmittelbare Visualisierung der Injektionsstelle.

Mehrere kritische.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910