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* これらの著者は同等に貢献しました
本プロトコルは、色素および凍結切片を用いてウイルス追跡を行う前に、脳定位固定装置注射座標の検証ステップを迅速化するための実際的な戦略を説明しています。
特定の脳領域の定位固定装置注射は、基礎神経科学における基本的な実験手法を構成しています。研究者は通常、マウスの脳アトラスや、さまざまな集団/年齢のマウス、さまざまな定位固定装置を使用した公開資料に基づいて定位固定装置注射パラメータを選択するため、定位固定装置の座標パラメータをさらに検証する必要があります。カルシウムイメージング、化学遺伝学、および光遺伝学的操作の有効性は、関心領域内のレポーター遺伝子の正確な発現に依存しており、多くの場合、数週間の努力が必要です。そのため、目的の脳領域の座標を事前に確認しておかないと手間のかかる作業になります。ウイルスの代わりに適切な色素を使用し、クライオセクショニングを実施することで、研究者は色素投与後すぐに注入部位を観察することができます。これにより、実際の注入部位と理論上の位置との間に不一致がある場合に、パラメータを調整するためのタイムリーな調整が容易になります。このような調整により、その後の実験における標的領域内でのウイルス発現の精度が大幅に向上します。
in vivoカルシウム記録、光遺伝学、化学遺伝学など、現代のほぼすべての神経調節ツールは、脳の関心領域を標的とするために定位固定座標の使用を必要としています1,2,3、神経操作の基礎を形成しています。マウスの脳領域の定位固定装置座標は、頭蓋骨の骨のランドマークであるブレグマとラムダに関連して定義され、いわゆる頭蓋骨由来の定位固定装置座標系を形成します。bregma と lambda のどちらかが 3 次元座標のゼロ点として機能します。3つの軸は、前後軸(AP)、中外側軸(ML)、背腹軸(DV)で、脳定位固定装置のデジタルディスプレイ上のy軸、x軸、z軸を表しています。周知の脳領域については、特定の領域の定位固定座標パラメータは、マウス脳アトラス4(例えば、定位座標におけるPaxinosおよびFranklinのマウス脳)および/または公開された文献5,6から得ることができる。ただし、脳定位固定装置のバリエーションや、研究者によって使用されるマウスの年齢/個体群が異なるため、さらなる検証が必要です。
構造は機能の....
すべての動物実験は、Animal Research Reporting In Vivo Experiments(ARRIVE)ガイドラインおよびNational Institutes of Health Guides for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠して実施されました。本研究は、上海交通大学医学部仁済病院の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、生後8週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しました。動物は商業的に入手され( 材料の表を参照)、標準的なケージ(22°C±2°C、12時間/12時間の明暗サイクル、餌、水を自由に)に収容されました。
1. 標的となる脳領域の選択
注:これは滅菌手順です。すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください。手術器具と接触する前に、手袋にアルコールをスプレーしてください。器具の先端や手術部位に手袋をはめて触れないでください。処置を開始する前に、矯正反射の喪失や皮膚刺激に対する反応がないことを確認して、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。穿孔と注射の前に、呼吸数(毎分60〜220呼吸、毎分平均100〜150呼吸)と呼吸振幅(一貫していて、浅すぎたり深すぎたりしないように)を注意深く監視します。呼吸数または振幅の大幅な変化に注意....
この研究では、実証された方法を使用して、30分以内に注射部位を特定することに成功しました。最初に、ブロモフェノールブルーを含むSDS-PAGEサンプルローディング溶液をC57/BLマウスのLDTgVに注入しました。 図1A は、色素溶液注入の概略図を示しています。LDTgV中の青色色素の分布を 図1Bに示します。
ブロモフェノールブル?.......
この記事では、ウイルス追跡の前に脳定位注射5,6の精度をより迅速かつ簡単に検証するための安定した戦略について説明しましたが、脳領域でのレポーター遺伝子発現のかけがえのない側面は、脳領域の標識にとって非常に重要です。使用した青色の染料により、注射部位を即座に視覚化することができました。
このプロトコ.......
著者は、競合する利益を宣言しません。
中国国家自然科学基金会(XY Sunに助成金NO.82101249)、中国ポスドク研究基金会(XY Sunに助成金NO.2022M722125)。上海セーリングプログラム(SHチェンへの助成金番号21YF1425100)。上海市衛生健康委員会臨床研究特別プロジェクト(J Zhouに助成金NO.202340088)。中国国立自然科学基金会(X Zhangに助成金NO.82101262、SH Chenに助成金NO.82101287)。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
20 mL syringe | Kindly group | ||
3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
Cellsens dimension software | Olympus | ||
Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
Drill | Longxiang | ||
Fine brushes | HWAHONG | ||
Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
freezing microtome | Leica | CM1950 | |
Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
Microtome blades | Leica | 819 | |
Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
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