クライオセクショニングによる脳定位固定装置注射座標の予備検証

要約

本プロトコルは、色素および凍結切片を用いてウイルス追跡を行う前に、脳定位固定装置注射座標の検証ステップを迅速化するための実際的な戦略を説明しています。

要約

特定の脳領域の定位固定装置注射は、基礎神経科学における基本的な実験手法を構成しています。研究者は通常、マウスの脳アトラスや、さまざまな集団/年齢のマウス、さまざまな定位固定装置を使用した公開資料に基づいて定位固定装置注射パラメータを選択するため、定位固定装置の座標パラメータをさらに検証する必要があります。カルシウムイメージング、化学遺伝学、および光遺伝学的操作の有効性は、関心領域内のレポーター遺伝子の正確な発現に依存しており、多くの場合、数週間の努力が必要です。そのため、目的の脳領域の座標を事前に確認しておかないと手間のかかる作業になります。ウイルスの代わりに適切な色素を使用し、クライオセクショニングを実施することで、研究者は色素投与後すぐに注入部位を観察することができます。これにより、実際の注入部位と理論上の位置との間に不一致がある場合に、パラメータを調整するためのタイムリーな調整が容易になります。このような調整により、その後の実験における標的領域内でのウイルス発現の精度が大幅に向上します。

概要

in vivoカルシウム記録、光遺伝学、化学遺伝学など、現代のほぼすべての神経調節ツールは、脳の関心領域を標的とするために定位固定座標の使用を必要としています^1,2,3、神経操作の基礎を形成しています。マウスの脳領域の定位固定装置座標は、頭蓋骨の骨のランドマークであるブレグマとラムダに関連して定義され、いわゆる頭蓋骨由来の定位固定装置座標系を形成します。bregma と lambda のどちらかが 3 次元座標のゼロ点として機能します。3つの軸は、前後軸(AP)、中外側軸(ML)、背腹軸(DV)で、脳定位固定装置のデジタルディスプレイ上のy軸、x軸、z軸を表しています。周知の脳領域については、特定の領域の定位固定座標パラメータは、マウス脳アトラス⁴(例えば、定位座標におけるPaxinosおよびFranklinのマウス脳)および/または公開された文献^5,6から得ることができる。ただし、脳定位固定装置のバリエーションや、研究者によって使用されるマウスの年齢/個体群が異なるため、さらなる検証が必要です。

構造は機能の基本です。神経回路は、認知活動、感情、記憶、感覚、運動機能など、多くの脳機能の基盤を形成しています¹。神経回路の構造をラベリングし、その活動を操作することは、特定の神経回路の機能を理解するために不可欠です。過去数十年にわたり、ニューラルトレーサーは何世代にもわたって進化してきました。初期の研究では、前向性トレーサーとして小麦胚芽凝集素(WGA)と尋常性凝集素(PHA)が採用され、逆行性トレーサーとしてフルオロゴールド(FG)、コレラ毒素サブユニットB(CTB)、カルボシアニンが採用されました。しかし、ウイルストレーサーとは異なり、これらの従来のニューラルトレーサーは外因性遺伝子を宿主に組み込むことができず、細胞型選択性も持っていません。今日、ウイルス戦略は基礎神経科学研究における重要な命題となっています。さまざまな研究目的のために、さまざまなウイルスツールを選択できます^7,8。非トランスシナプスウイルス、トランスマルチシナプスウイルス(逆行性および前行性)、およびトランスモノシナプスウイルス(逆行性および前行性)があります。各カテゴリには、それぞれの特性を持ついくつかのタイプが含まれています。

ウイルスの投与と発現のプロセスは非常に時間とリソースを大量に消費し、多くの場合、数週間またはそれ以上かかります。様々なウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは遺伝子送達の有望な手段として同定されており、^{実験手順7,8}のために注射後3〜8週間の範囲の広いウィンドウを提供する。AAVが進化するにつれて、投与後2〜3週間で分析を行うことができる^9,10。偽狂犬病ウイルス(PRV)や狂犬病ウイルス(RV)などの他の神経回路トレーサーも、少なくとも2〜7日の追跡期間を必要とします11,12,13,14,15。したがって、蛍光シグナルを観察する前に注入部位を事前に検証することは、時間と費用対効果の両方が高いです。

定位固定装置による注射を簡単かつ迅速に検証するために、この研究では、ウイルスベクターの前に色素を投与し、クライオ切片により、研究者は注射部位を観察し、注射後30分以内に追跡することができます。

プロトコル

すべての動物実験は、Animal Research Reporting In Vivo Experiments(ARRIVE)ガイドラインおよびNational Institutes of Health Guides for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠して実施されました。本研究は、上海交通大学医学部仁済病院の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、生後8週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しました。動物は商業的に入手され( 材料の表を参照)、標準的なケージ(22°C±2°C、12時間/12時間の明暗サイクル、餌、水を自由に)に収容されました。

1. 標的となる脳領域の選択

注:これは滅菌手順です。すべての手術器具が滅菌されていることを確認してください。手術器具と接触する前に、手袋にアルコールをスプレーしてください。器具の先端や手術部位に手袋をはめて触れないでください。処置を開始する前に、矯正反射の喪失や皮膚刺激に対する反応がないことを確認して、マウスが適切に麻酔されていることを確認してください。穿孔と注射の前に、呼吸数(毎分60〜220呼吸、毎分平均100〜150呼吸)と呼吸振幅(一貫していて、浅すぎたり深すぎたりしないように)を注意深く監視します。呼吸数または振幅の大幅な変化に注意する必要があります。.

1. 29 Gの針を使用して、1.25%トリブロモエタノール(250 mg / kg)の腹腔内注射でマウスを麻酔します。.立ち直り反射が消えたら、頭蓋骨の毛を剃ります。マウスを脳定位固定装置フレーム( 資料の表を参照)に固定するには、上切歯をノーズクランプで固定し、2本のイヤーバーで頭を安定させます。
2. 眼の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布します。頭皮をアネルディアン(消毒液; 材料の表を参照)で3回拭いて消毒します。.29 Gのインスリン針を使用して0.2 mLの1%リドカインを皮下に注射し、局所鎮痛を提供します。.
3. アイハサミを使用して0.5cmの切開を行い、頭蓋を露出させます。3%H₂O₂ に浸した綿棒を使用して、露出した頭蓋骨をこすり、骨膜を取り除きます。頭蓋骨を乾かします。
4. ドリルを脳定位固定装置に取り付けます。拡大鏡を使用してドリルチップをブレグマに正確に配置するように脳定位固定アームのノブを調整し、LCDデジタルディスプレイを使用してz軸値を記録します。
   1. ノブを調整し、ドリルチップをラムダに配置し、z軸の値を記録します。ノーズclを調整しますamp とイヤーバー 2つのz値を近づけ、2つのz値の差が0.1 mm未満になるまで上記の手順を繰り返します。
      注意: LCDデジタルディスプレイのx、y、およびz軸は、それぞれ中外側(ML)、前後(AP)、および背腹(DV)に対応します。ブレグマとラムダは、2 つの z 値の差が 0.1 mm 未満になると、同じ水平面上にあると見なすことができます。
5. 脳の左右の水平性を確保します。脳定位固定装置フレームに取り付けられているイヤーバーを同じスケールで調整します。例えば、後咽側被蓋核、腹側部分(LDTgV)を取ります。その定位座標は、Xが-5.2、Yが+0.8、Zが-4.0であると、PaxinosとFranklinのマウス脳アトラス¹⁶によると。
   1. イヤーバーを調整してドリルを(-5.2、+ 0.8)にして背腹方向のz値を測定し、ドリルを(-5.2、-0.8)に移動してz値を測定します。
      注意: 2つのz値の差が0.2 mm未満の場合、左右は等しいレベルにあると見なされます。耳道は対称的であるため、イヤーバーは適切な場所に挿入する必要があります。2つのz値の差が0.5mmを超えると、イヤーバーが間違った場所に挿入されている可能性があります。
6. ドリルを再びブレグマに合わせ、LCDデジタルディスプレイの3つの座標をゼロに設定します。参照座標を使用して、ドリルを関心領域の上に配置します。ドリルを開始します。
   1. 垂直アームを使用して、ドリルが頭蓋骨を貫通するまでドリルを徐々に下げます。綿棒を使用して破片や血液を取り除きます。
      注意: 脳組織を傷つけないように注意してください。

2.色素溶液の調製と脳マイクロインジェクション

1. ブロモフェノールブルー( 材料表を参照)を含む25 μLのSDS-PAGEローディングバッファーを200 μLの微量遠心チューブに取ります。50 μLのddH₂Oをチューブに加えて、色素溶液を調製します。
2. 頭蓋窓を生理食塩水で湿らせた綿パッドで覆います。生理食塩水を繰り返し吸引および排出することにより、マイクロシリンジの開存性を確保します。0.3 μLの色素をマイクロシリンジにロードします。シリンジと電動定位固定装置マイクロインジェクターを脳定位固定装置アームに取り付けます。
3. シリンジの先端をブレグマに置き、LCDデジタルディスプレイで座標をゼロに設定します。参照座標に従って、針を関心領域に調整します。注入速度を0.1 μL/minに設定し、電動マイクロインジェクターを始動して、0.3 μLの青色色素をターゲット領域に送達します。注射器を少なくとも10分間所定の位置に置いてから、インジェクターをゆっくりと引き抜きます。.
   注:同じマウスで異なる色の染料を使用して、近接した領域を区別することができます。他の染料は、その物理的特性に基づいて適切な濃度でテストします。ブロモフェノールブルー処方を使用し、閉塞を防ぐために使用前と使用後にシリンジを十分にすすぐことをお勧めします。色素の拡散に基づいて注入量を調整します。

3. 脳組織の採取と凍結切片

1. マウスを定位固定装置フレームから離します。29 G の針を使用して、50 mg/kg のペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。マウスをテープで発泡スチロールボードに固定します。
2. 胸部の両側を開いて急速な窒息を誘発します。右心房付属器に1〜2mmの切開を行います。左心室に注入針を挿入します。予冷した生理食塩水20mLと氷漬けの4%パラホルムアルデヒド溶液20mLを注入します。
3. 組織解剖ハサミでマウスの首を切ります(制度的に承認されたプロトコルに従います)。首から鼻までの正中線に沿って切開して皮膚を切除し、頭蓋骨を露出させます。鉗子やハサミで頭蓋骨に残っている筋肉を取り除きます。
4. 細いハサミの片方の刃の先端を大孔と脳の間に置き、鋭いエッジを骨に向けて、矢状中央縫合糸の吻側端に配置します。スライドして、矢状中央縫合糸に沿って頭蓋骨を切断します。鉗子を使用して頭蓋骨を切除し、露出した脳を露出させます。
   注意: 手術中に脳に損傷を与えないように注意してください。骨片を取り除く前に、頭蓋骨に付着している可能性のある髄膜を慎重に剥がしてください。この予防措置は、プロセス中に脳組織が誤ってスライスされるのを防ぐために重要です。
5. 回転式ミクロトームクライオスタット( 材料の表を参照)の電源を入れ、チャンバー温度を-20°Cに設定します。 OCTコンパウンドを少量注ぎ、試料ディスクの表面を均一に覆います。それをクライオチャンバーに入れ、OCTが固まるのを待ちます。
6. ディスクを試料ヘッドに取り付けます。ブレードをブロックに近づけ、OCTブロックをトリミングして、ディスクと平行な平面を作ります。
7. 脳をシェービングブレードで脳スライス型で注射部位から離れた冠状方向に切断します。注射部位を含む脳組織を、切断面を下にしてOCT平面に置きます。
   1. OCTを脳に注ぎ、椎間板をクライオチャンバーに入れると、検体ブロックが固化します。脳にOCTが完全に埋め込まれるまで、OCTを繰り返し脳に注ぎます。
      注:OCTコンパウンドをレイヤーごとに追加します。OCTの前の層が凍結したら、OCT化合物の次の層を脳に注ぎます。
8. ターゲット領域が近づくまで試験片ブロックをトリミングします。注入部位レベルからいくつかのセクションを作成します。-20°Cに保たれた小さな筆を使用して、室温PBSを含む6ウェルプレートに冠状脳スライスを収集します。
   注意: 切断厚さを大きいものに設定してブロックをトリミングし、ブレードが注入部位に近づくにつれて切断厚さを40μmに設定します。神経回路トレーサーを使用する場合、マウスはすぐに犠牲にされません。麻酔からの回復のために、マウスを滅菌した術後回復ケージに加熱ブランケットの上に置きます。マウスを元のケージに戻すか、目覚めたら新しいケージに戻します。

4. イメージング

1. OCTを室温のPBSで洗浄します。ブラシを使って脳の切片を拾い上げ、スライド上に置きます。セクションを室温で風乾させます。
2. 注入された領域を視覚的に観察するか、標的核が極小の場合は顕微鏡を使用します。注入した色素の位置を脳アトラスの対応する領域と比較します。
   注:X、Y、およびZ軸の値は、注入点の偏差の方向と距離に応じて調整します。座標を正確に決定するために、このプロトコルのすべての手順を複数回繰り返す必要がある場合があります。

結果

この研究では、実証された方法を使用して、30分以内に注射部位を特定することに成功しました。最初に、ブロモフェノールブルーを含むSDS-PAGEサンプルローディング溶液をC57/BLマウスのLDTgVに注入しました。 図1A は、色素溶液注入の概略図を示しています。LDTgV中の青色色素の分布を 図1Bに示します。

ブロモフェノールブル?...

ディスカッション

この記事では、ウイルス追跡の前に脳定位注射^5,6の精度をより迅速かつ簡単に検証するための安定した戦略について説明しましたが、脳領域でのレポーター遺伝子発現のかけがえのない側面は、脳領域の標識にとって非常に重要です。使用した青色の染料により、注射部位を即座に視覚化することができました。

このプロトコ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910