مقايسة شفط ميكروماصة مضان للتحقيق في ميكانوسن خلايا الدم الحمراء

Summary

يعد استكشاف السلوك الخلوي تحت الضغط الميكانيكي أمرا محوريا للتقدم في الميكانيكا الخلوية وعلم الأحياء الميكانيكي. نقدم تقنية شفط الماصة الدقيقة الفلورية (fMPA) ، وهي طريقة جديدة تجمع بين التحفيز الميكانيكي المتحكم فيه والتحليل الشامل للإشارات داخل الخلايا في الخلايا المفردة. تبحث هذه التقنية في دراسات متعمقة جديدة لعلم الأحياء الميكانيكية للخلايا الحية.

Abstract

لطالما كانت فحوصات شفط الماصة الدقيقة حجر الزاوية في التحقيق في ميكانيكا الخلايا الحية ، حيث تقدم رؤى حول الاستجابات الخلوية للإجهاد الميكانيكي. توضح هذه الورقة بالتفصيل تكيفا مبتكرا لمقايسة شفط الماصة الدقيقة المقترنة بالفلورة (fMPA). يقدم اختبار fMPA القدرة على إدارة قوى ميكانيكية دقيقة مع مراقبة عمليات النقل الميكانيكي للخلايا الحية بوساطة القنوات الأيونية في نفس الوقت. يشتمل الإعداد المتطور على ماصة دقيقة من زجاج البورسليكات المصمم بدقة ومتصلة بخزان مياه منظم بدقة ونظام شفط هوائي ، مما يسهل تطبيق الضغط المتحكم فيه بزيادات تصل إلى ± 1 مم زئبق. ومن التحسينات المهمة دمج التصوير الفلوري الوهمي ، مما يسمح بالمراقبة المتزامنة والقياس الكمي للتغيرات المورفولوجية للخلايا وتدفقات الكالسيوم داخل الخلايا أثناء الشفط. يضع اختبار fMPA ، من خلال مزيجه التآزري من التصوير الفلوري epi-fluorescence مع شفط الماصة الدقيقة ، معيارا جديدا لدراسة الاستشعار الميكانيكي للخلايا في البيئات الصعبة ميكانيكيا. هذا النهج متعدد الأوجه قابل للتكيف مع الإعدادات التجريبية المختلفة ، مما يوفر رؤى نقدية حول آليات الاستشعار الميكانيكي أحادية الخلية.

Introduction

أبرزت الاكتشافات التي تتكشف في عالم السلوكيات الخلوية دور المحفزات الميكانيكية ، مثل التوتر ، وإجهاد قص السوائل ، والضغط ، وصلابة الركيزة ، في إملاء الأنشطة الخلوية الديناميكية مثل الالتصاق والهجرة والتمايز. هذه الجوانب الميكانيكية البيولوجية لها أهمية قصوى في توضيح كيفية تفاعل الخلايا مع بيئاتها الفسيولوجية والاستجابة لها ، مما يؤثر على العمليات البيولوجية المختلفة ^1,2.

على مدى العقد الماضي ، برزت مقايسات الشفط القائمة على الماصة الدقيقة كأداة متعددة الاستخدامات في دراسة الاستجابات الخلوية المتنوعة للمنبهات الميكانيكية. تقدم هذه التقنية رؤى قيمة حول الخصائص الميكانيكية الجوهرية للخ....

Protocol

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة سيدني وقد تمت الموافقة عليها. تم الحصول على موافقة مستنيرة من الجهات المانحة لهذه الدراسة.

1. عزل كرات الدم الحمراء البشرية

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة 1.1 من قبل أخصائي فصد مدرب باستخدام بروتوكول تمت الموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية.

1. اسحب 5 مل من الدم من الوريد المرفقي المتوسط باستخدام إبرة فراشة 19 جرام.
2. نقل الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1: 200 إينوكسابارين لمنع التخثر.
3. تمييع 5 ميكرولتر من الدم المضاد للتخثر enoxaparin في 1 مل من المخزن المؤقت للكربونات / البيكربونا....

النتائج

لإنشاء مقايسات شفط الماصة الدقيقة ، قمنا أولا ببناء غرفة خلية مخصصة تتكون من مربعين معدنيين (نحاس / ألومنيوم) متصلين بمقبض. تم لصق غطاءين زجاجيين من القطع الثالث (40 مم × 7 مم × 0.17 مم) لإنشاء غرفة مليئة ب 200 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المعلقة في Tyrode's Buffer. بعد إدخال كرات الدم الحمراء في الغرفة .......

Discussion

تجسد فحوصات شفط الماصة الدقيقة منهجية محسنة ، حيث تنشر تعديلا كبيرا للضغط ، وتنسيقا مكانيا دقيقا ، وتمييزا زمنيا موثوقا به لاستكشاف التعقيدات العميقة للميكانيكا الحيوية الخلوية. تركز هذه الدراسة بشكل خاص على تطبيق fMPA كأداة حاسمة للكشف عن الاستجابات الدقيقة الحساسة للميكانيكا التي أظهرت.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system