АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Изучение поведения клеток при механическом напряжении имеет решающее значение для достижений в клеточной механике и механобиологии. Мы представляем метод флуоресцентной микропипеточной аспирации (fMPA), новый метод, сочетающий контролируемую механическую стимуляцию с комплексным анализом внутриклеточной сигнализации в отдельных клетках. Этот метод исследует новые углубленные исследования механобиологии живых клеток.

Аннотация

Аспирационные анализы с помощью микропипеток уже давно являются краеугольным камнем для исследования механики живых клеток, давая представление о клеточных реакциях на механический стресс. В данной статье подробно описывается инновационная адаптация метода аспирации микропипеток с флуоресцентной связью (fMPA). Анализ fMPA дает возможность управлять точными механическими силами при одновременном мониторинге процессов механотрансдукции живых клеток, опосредованных ионными каналами. Сложная установка включает в себя прецизионную микропипетку из боросиликатного стекла, подключенную к точно регулируемому резервуару для воды и пневматической системе аспирации, что облегчает применение контролируемого давления с шагом ± 1 мм рт. ст. Существенным усовершенствованием является интеграция эпифлуоресцентной визуализации, позволяющая одновременно наблюдать и количественно оценивать морфологические изменения клеток и внутриклеточные потоки кальция во время аспирации. Анализ fMPA, благодаря синергетическому сочетанию эпифлуоресцентной визуализации с аспирацией микропипеток, устанавливает новый стандарт для изучения клеточного механочувствия в механически сложных средах. Этот многогранный подход может быть адаптирован к различным экспериментальным установкам, обеспечивая критически важное представление о механизмах механочувствительности отдельных клеток.

Введение

Открытия в мире клеточного поведения подчеркнули роль механических стимулов, таких как растяжение, напряжение сдвига жидкости, сжатие и жесткость субстрата, в определении динамических клеточных активностей, таких как адгезия, миграция и дифференциация. Эти механобиологические аспекты имеют первостепенное значение для выяснения того, как клетки взаимодействуют с физиологической средой и реагируют на нее, влияя на различные биологические процессы 1,2.

За последнее десятилетие аспирационные анализы на основе микропипеток стали универсальным инструментом в изучении различных клеточных реакций на механические раздражители. Этот метод дает ценную информацию о внутренних механических свойствах живых клеток на уровне одной клетки, включая модуль упругости клеток, жесткость и напряжение коры головного мозга. Эти анализы позволяют измерять различные механические параметры, такие как натяжение клеточной мембраны, давление, оказываемое на клеточную мембрану, и кортикальное напряжение (обобщенное в таблице 1). Изучение аспиративных сил обогатило наше понимание того, как они влияют на клеточные функции и процессы, особенно в области мембранной динамики, включая фрагментацию, удлинение и почкование 3,4.

Механический параметрОписаниеОсновополагающие подходы
Жесткость ячеекИзмерение механической жесткости и эластичности ячейки.Аспирация клеточной мембраны и анализ деформационной реакции на отрицательное давление20,21.
Адгезионная прочностьОценка того, насколько сильно клетки прилипают к поверхностям.Применение контролируемого отсоса для отделения прилипших клеток от субстрата2,22.
Натяжение мембраныОценка напряжения или стресса в клеточных мембранах.Измерение деформации мембраны в ответ на приложенное давление23,24.
Вязкоупругие свойстваХарактеристика комбинированного вязкого и упругого поведения клетки.Анализ нестационарной деформационной реакции на аспирацию23,25.
ДеформативностьОпределение того, насколько легко клетка может менять форму.Оценка степени деформации при контролируемом всасывании20,24.
Поверхностное натяжениеИзмерение натяжения на поверхности ячейки.Оценка давления, необходимого для формирования выпячивания мембраны микропипетки26.
Взаимодействие клетки с материаломИзучение взаимодействий между клетками и материалами или субстратами.Аспирация клеток, контактирующих с различными материалами, и наблюдение за взаимодействиями2,24.
Межклеточное взаимодействиеИзучение взаимодействий между соседними клетками.Аспирация группы клеток и анализ их межклеточных сил27.

Таблица 1: Механические параметры, характеризуемые микропипеточным аспирационным анализом.

Метод аспирации на основе микропипеток широко используется для изучения эритроцитов (эритроцитов), оценки деформируемости и различных механических характеристик эритроцитов, что имеет важное значение для понимания их функции в системе кровообращения. Эритроциты демонстрируют замечательную приспособляемость, сохраняя свою механическую универсальность против деформации при навигации через сложную капиллярную сеть и межэндотелиальные щели 5,6. Во время этого путешествия эритроциты должны проходить через проходы шириной 0,5-1,0 мкм, подвергаясь воздействию множества механических сил, включая растяжение и сжатие 7,8,9. Они также обладают высокой чувствительностью к напряжению сдвига, создаваемому кровотоком во времяциркуляции 10. Эти процессы способствуют активации регуляторных механизмов, включающих приток кальция, важнейшее сигнальное событие, играющее хорошо известную роль в клеточных реакциях на механические раздражители11,12. Сложные механизмы, управляющие кальций-опосредованным механозондированием, остаются неотразимыми предметами продолжающихся исследований.

В этом контексте фМПА является эффективным подходом к выявлению степени мобилизации кальция при точно контролируемых механических силах, позволяющим одновременно применять механическую модуляцию (с помощью системы аспирации микропипеток) и визуализацию интенсивности кальция (с помощью флуоресцентных индикаторов). В частности, он имитирует физиологический сценарий, когда эритроциты проходят через сужающиеся кровеносные сосуды. Стоит отметить, что разработанная нами система fMPA может генерировать давление с разрешением 1 мм рт. Реализованная высокоскоростная камера позволяет достигать временного разрешения 100 мс и пространственного разрешения на уровне субмикронного метра. Эти конфигурации обеспечивают точное приложение механических сил к живым клеткам и одновременно улавливают результирующую клеточную сигнализацию. Кроме того, благодаря интегративному инженерному характеру этой установки, аспирационный анализ с помощью микропипеток может быть легко адаптирован к другому оборудованию или методам, что позволяет глубже исследовать тонкости клеточной механики. Эта универсальность является дополнительным преимуществом такого подхода.

протокол

Этот протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований на людях Сиднейского университета. Для проведения данного исследования было получено информированное согласие доноров.

1. Изоляция эритроцитов человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.1 должен выполняться квалифицированным флеботомистом с использованием протокола, одобренного Институциональным наблюдательным советом.

  1. Возьмите 5 мл крови из срединной кубитальной вены с помощью иглы-бабочки 19 G.
  2. Переложите собранную кровь в пробирку объемом 15 мл, содержащую эноксапарин в соотношении 1:200 для предотвращения свертывания крови.
  3. Развести 5 мкл эноксапарин-антикоагулянтной крови в 1 мл карбонатного/бикарбонатного буфера (С-буфер, рН = 8,5-9; Оглавление материалов).
  4. Центрифугируют разбавленный образец крови при 900 × г в течение 1 мин для осаждения эритроцитов. Осторожно сцедите надосадочную жидкость, не повредив гранулу.
  5. Проводят две промывки гранул эритроцитов 1 мл С-буфера (таблица материалов), каждый раз центрифугируя при 900 × г в течение 1 мин.
  6. Затем промывают гранулу эритроцитов 2 раза 1 мл буфера Tyrode, используя те же условия центрифугирования, а затем повторно суспендируют конечную гранулу в 1 мл буфера Tyrode для получения суспензии промытых эритроцитов.

2. Нагрузка кальциевым индикатором

  1. Отрегулируйте концентрацию промытого исходного раствора эритроцитов до 10 × 106 клеток/мл в буфере Tyrode на основе количества клеток, полученного с помощью автоматического счетчика клеток (таблица материалов).
  2. Маркировку кальция внутри эритроцитов путем инкубации с кальций-чувствительным красителем Cal-520 AM 16,67 мкМ при перемешивании на ротационном трубчатом смесителе в течение 1 ч.
  3. Разбавьте эритроциты в буфере Tyrode, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в соотношении 1:50. Теперь клетки готовы к экспериментальному использованию.

3. Изготовление микропипеток

  1. Установите капиллярную трубку из боросиликатного стекла (наружный диаметр 1 мм x внутренний диаметр 0,6 мм) на съемник микропипеток P-1000 для получения двух соответствующих микропипеток с закрытыми наконечниками в месте вытягивания с помощью предварительно заданной программы вытягивания. Для этой настройки используйте следующие значения программы вытягивания: нагрев 516, тяга 150, скорость 75, время 250 и давление 500.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры нагрева и вытягивания, заданные в программе вытягивания, могут быть настроены и зависят от желаемых настроек экспериментальной конструкции12. КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1).
  2. Откройте закрытый наконечник, установив одну из микропипеток с закрытым концом, приобретенных после натягивания на резак для микропипеток. Отрегулируйте температуру нагрева примерно до 50-60 °C.
  3. Найдите микропипетку с помощью окуляра с 10-кратным увеличением. Переместите микропипетку ближе к шарику из боросиликатного стекла, используя ручки для регулировки.
  4. Установите окуляр на 30x, прежде чем расположить микропипетку как можно ближе к шарику боросиликатного стекла, не сгибая наконечник пипетки.
  5. Размягчите шарик боросиликатного стекла с помощью тепла, наступив на педаль нагрева. Осторожно вставьте необработанный закрытый наконечник микропипетки в размягченный шарик до тех пор, пока не будет достигнута желаемая конечная точка, диаметр отверстия.
  6. Отпустите педаль и дайте стеклянной бусине остыть. Следите за тем, чтобы кончик микропипетки всегда оставался внутри шарика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая установка наконечника приводит к увеличению диаметра отверстия.
  7. Осторожно извлеките микропипетку, чтобы получить четкий прямой срез на закрытой микропипетке. Убедитесь, что конечный диаметр капилляра составляет 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1)

4. Подготовка камеры ячейки

  1. С помощью алмазного карандаша разделите стандартный стеклянный листок размером 40 мм x 22 мм x 0,17 мм на три равные полосы.
  2. Приклейте один кусок вырезанного стеклянного защитного стекла к нижней части самодельного держателя камеры с помощью вакуумной смазки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держатель патронника состоит из двух металлических (медных/алюминиевых) квадратов, соединенных изогнутой ручкой. Расстояние между металлическими блоками должно быть менее 40 мм, чтобы разрезанный покровный щиток прилегал к держателю и образовывал параллельную камеру.
  3. Приклейте второй кусок вырезанного стеклянного покровного стекла к верхней части самодельного держателя камеры с помощью вакуумной смазки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1)
  4. Введите 200 мкл меченой суспензии эритроцитов между двумя покровными стеклами с помощью пистолета-пипетки на 200 мкл (рис. 1).

figure-protocol-5416
Рисунок 1: Иллюстрация камеры ячейки. Два вырезанных куска стеклянной крышки размером 40 мм x 22 мм x 0,17 мм приклеиваются к держателю камеры с помощью смазки. Между двумя вырезанными стеклянными покровными стеклами помещается примерно 200 мкл клеточного раствора в буфере Tyrode. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

5. Узел аспирации микропипетки

  1. Установите камеру ячейки на столик-держатель, установленный на платформе микроскопа. Отрегулируйте положение так, чтобы камера ячейки находилась прямо над объективом (Рисунок 2B).
  2. Опустите держатель микропипетки ниже уровня жидкости в подключенном резервуаре для воды.
  3. Введите деминерализованную воду или буфер Tyrode в изготовленную микропипетку и осторожно удалите все пузырьки воздуха с помощью шприца в сочетании с иглой 34 G (см. Таблицу материалов).
  4. Отвинтите конец держателя микропипетки наполовину и дайте воде стечь из держателя микропипетки в течение нескольких секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1)
  5. Вставьте микропипетку в наконечник держателя. Затяните винт держателя, чтобы убедиться, что микропипетка зафиксирована.
  6. Вставьте микропипетку в камеру клетки и найдите микропипетку и эритроциты под микроскопом. Используйте микроманипулятор для регулировки положения.
  7. Опустите наконечник микропипетки еще ниже, чтобы убедиться, что наконечник находится на одном уровне с расположенными эритроцитами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: КОНТРОЛЬНАЯ ТОЧКА (см. Дополнительную таблицу S1)
  8. Обнулите гидравлическое давление на наконечнике микропипетки, отрегулировав высоту резервуара для воды. Затем слегка приподнимите резервуар для воды, чтобы создать легкое положительное давление на кончике.

6. Выполните аспирационный анализ микропипеток с флуоресцентной связью

  1. Включите источник флуоресцентного возбуждающего света с длиной волны 488 нм. Не включайте флуоресцентный затвор на этом этапе, чтобы избежать фотообесцвечивания (Рисунок 2C). Включите флуоресцентную камеру и передающую камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обе камеры управляются с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
  2. Установите желаемое время экспозиции (100 мс для обеих камер в этом исследовании), область интереса (ROI), размер биннинга (нет для этого исследования) для обеих камер в программном обеспечении. Откройте панель многомерного сбора , чтобы установить номер кадра съемки, 2 000 для этого исследования и каталог сохранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Номер кадра регистрации зависит от желаемого количества событий аспирации, которые должны быть записаны. Для 1 события аспирации диапазон числа захвата должен быть установлен в пределах 100-500, что составляет примерно 10-50 с.
  3. Найдите микропипетку под полем зрения с помощью микроманипулятора.
  4. Включите пневматический зажим давления, включая блок управления и систему зажимов (Рисунок 2A). Убедитесь, что блок управления находится в режиме EXTRNL. Компенсируйте любое смещение давления внутри системы, медленно вращая ручку.
  5. Включите отдельное программное обеспечение, которое управляет пневматическим зажимом. Программное обеспечение имеет электрическую панель управления для управления дискретным аналоговым входом в систему зажимов. Давление регулируется с помощью коэффициента пересчета 20 мВ/мм рт.ст.
  6. Обнулите давление внутри системы. Осторожно расположите микропипетку близко к эритроцитам. Отрегулируйте положение резервуара для воды до тех пор, пока на кончике микропипетки не появится легкое положительное давление.
  7. Запустите съемку в программном обеспечении, управляющем камерой. Включите люминесцентный затвор.
  8. Аспирируйте эритроциты, введя рассчитанную величину напряжения в панель управления, чтобы достичь желаемого давления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Давление для аспирации эритроцитов обычно находится в диапазоне Δp = от -5 до -40 мм рт.ст. В пределах кончика микропипетки должно быть заметное удлинение языка (рис. 2D).
  9. Удерживайте давление в течение заданного периода времени; Затем ослабьте давление.
  10. Переместите микропипетку, чтобы взять следующую клетку, и повторите эксперимент.

7. Анализ интенсивности флуоресценции

  1. Загрузите сохраненные флуоресцентные изображения в аналитическое программное обеспечение.
  2. Отрегулируйте порог интенсивности с помощью вкладки настройки дисплея . Это можно сделать, либо вручную введя значения, либо используя ползунок, чтобы убедиться, что флуоресцентные изображения показывают четкий контраст клетки в аналитическом программном обеспечении (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S1).
  3. Прокрутите страницу до временной шкалы в нижней части программного обеспечения. Найдите обозначенное событие аспирации.
  4. Нажмите кнопку Добавить новые поверхности. Определите рентабельность инвестиций в анализ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение предоставляет управляемый пятиступенчатый процесс для настройки и завершения сегментации (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S2 и Дополнительный рисунок S3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите окупаемость инвестиций как можно меньше, чтобы сэкономить вычислительные ресурсы.
  5. Используйте ползунок «Вычитание фона» и отрегулируйте порог сегментации с помощью ползунка, чтобы получить наилучший результат сегментации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это означает, что, за исключением события аспирации, фон должен быть сегментирован как можно точнее (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S4 и Дополнительный рисунок S5).
  6. Добавьте фильтр по площади для исключения фоновых шумов (см. Дополнительный файл 1-Дополнительный рисунок S6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это выполняется на этапе постобработки.
  7. Выберите вкладку статистики | Подробная вкладка | вкладка «Средние значения ». Прокрутите, чтобы найти и выбрать среднее значение интенсивности (см. Дополнительный файл 1 - Дополнительный рисунок S7).
  8. Экспортируйте трассировку сигнала флуоресценции с течением времени в файл .csv.
  9. Откройте экспортированный CSV-файл. Вычтите фоновые сигналы, Fb, из всех измерений.
  10. Рассчитайте изменение интенсивности кальция, ΔFmax, используя уравнение (1):
    figure-protocol-12724(1)
    Где ΔFmax — максимальное изменение интенсивности кальция, Fb — интенсивность фона, а F0 — интенсивность покоя.

figure-protocol-13084
Иллюстрация 2: Узел аспирации микропипеток с флуоресцентной связью. (A) Обзор аппаратной системы fMPA, включающей инвертированный микроскоп в сочетании со светлопольной и флуоресцентной камерами. В левой части изображения изображен самодельный водяной манометр и блок управления, позволяющий точно настроить давление пневматического нагнетательного насоса. (B) Столик микроскопа, изображающий камеру экспериментальной ячейки и систему микроманипулятора с одной микропипеткой. (C) Схема настройки системы fMPA. Одновременная визуализация светлопольных (желтый) и флуоресцентных (синее излучение, зеленое возбуждение) сигналов с использованием двух дихроичных зеркал для направления световых путей от источника флуоресцентного света (синий) к мишени, а затем к камерам для получения изображения (зеленый). (D) В верхнем ряду показаны изображения светлого поля, а в нижнем — флуоресцентные изображения. Слева показано положение микропипетки перед аспирацией, когда эритроциты находятся в состоянии покоя. В средней колонке показан процесс аспирации, в котором эритроциты испытывают отрицательное давление -40 мм рт. Справа показана морфология клеток после отрицательного аспирационного давления. Масштабная линейка = 5 мкм. Сокращения: fMPA = Аспирация микропипеток с флуоресцентной связью; DM = дихроичное зеркало; эритроциты = эритроциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Для проведения аспирационных анализов с помощью микропипеток мы сначала построили специальную камеру, состоящую из двух металлических квадратов (медь/алюминий), соединенных ручкой. Два стеклянных покровных стекла (40 мм × 7 мм × 0,17 мм) были прикреплены для создания камеры, заполненной 200 ...

Обсуждение

Аспирационные анализы с помощью микропипеток воплощают в себе усовершенствованную методологию, использующую существенную модуляцию давления, точную пространственную оркестровку и надежное временное различение для исследования глубоких тонкостей клеточной биомеханики. В этом иссл...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов, которые они могли бы сообщить в отношении настоящего исследования.

Благодарности

Мы благодарим Нурул Айшу Зайнал Абидин и Лауру Молдован за дополнительный набор доноров, сбор крови и поддержку флеботомии. Мы благодарим Томаса Андерсона и Ариана Насера за организацию оборудования и реагентов. Это исследование финансировалось Австралийским исследовательским советом (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. А.Дж.); Грант Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (APP2003904-L. А.Дж.); NHMRC Equipment Grant-L.A.J.; Программа наращивания потенциала в области сердечно-сосудистых заболеваний штата Новый Южный Уэльс (Грант для исследователей в начале и середине карьеры, Лос-Анджелес); Грант на исследовательские инновации NSW CVRN-VCCRI; Управление по глобальному и научно-исследовательскому взаимодействию (Премия за сотрудничество в партнерстве между Сиднеем и Глазго, Лос-Анджелес); L.A.J. является стипендиатом Национального фонда сердца 2-го уровня (105863) и стипендиатом Фонда медицинских исследований снега (2022SF176).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
µManagerMicro-ManagerVersion 2.0.0
1 mL Syringe Terumo210320DCooperate with the Microfil 
200 µL Pipette Eppendorf 3123000055Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover SlipsKnittel Glass MS0014Cell chamber assembly
50 mL Syringe Terumo220617EConnect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425Eppendorf 5405000280Red clood cell preparation
ClexaneSigma-Aldrich1235820To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQamiDiligent
Fluorescence light sourceCoolLEDpE-300Micropipette aspiration hardware system
Glass capillaryNarishigeG-1Micropipette manufacture
GlucoseSigma-AldrichG8270Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE cameraMantaG-040BMicropipette aspiration hardware system
High speed pressure clampScientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage Scientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
ImarisOxford Instruments
Inverted Microscopy Olympus Olympus IX83Micropipette aspiration hardware system
Microfil World Precision Instruments MF34G-534 G (67 mm Long)
Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip 
Micropipette Puller Sutter instrumentP1000Micropipette manufacture 
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification SystemMerck MilliporeZEQ7000T0CCarbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge NarishigeMF-900Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump Scientific InstrumentPV-PUMPInduce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera PhotometricsPrime 95B sCMOSFlourscent imaging
Rotary wheel remote unit Sensapex uM-RM3Control panel for micropipette position adjustment 
Scepter 3.0 Handheld Cell CounterMerck MilliporePHCC340KITAutomatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic
Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)		Sigma-AldrichS9638Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit Sensapex uM-TSCControl panel for micropipette position adjustment 
X dry Objective Olympus Olympus 60x/0.70 LUCPlanFLMicropipette aspiration hardware system

Ссылки

  1. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
  2. Mierke, C. T. . Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , (2021).
  3. Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
  4. Shin, J. -. W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
  5. Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
  6. Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
  7. Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979 (2017).
  8. Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -. T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
  9. Maître, J. -. L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
  10. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447 (2016).
  11. Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
  12. . Pipette Cookbook 2018 Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018)
  13. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  14. Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
  15. High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023)
  16. . Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020)
  17. Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105 (2016).
  18. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Current Opinion in Biotechnology. 25, 114-123 (2014).
  19. Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
  20. Oh, M. -. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886 (2012).
  21. Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
  22. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  23. Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
  24. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  25. Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
  26. Guevorkian, K., Maître, J. -. L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
  27. Biro, M., Maître, J. -. L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены