Test d’aspiration par micropipette à fluorescence pour étudier la mécanodétection des globules rouges

Résumé

L’exploration du comportement cellulaire sous stress mécanique est essentielle pour les progrès de la mécanique cellulaire et de la mécanobiologie. Nous introduisons la technique d’aspiration par micropipette de fluorescence (fMPA), une nouvelle méthode combinant une stimulation mécanique contrôlée avec une analyse complète de la signalisation intracellulaire dans des cellules individuelles. Cette technique étudie de nouvelles études approfondies de la mécanobiologie des cellules vivantes.

Résumé

Les tests d’aspiration par micropipette ont longtemps été la pierre angulaire de l’étude de la mécanique des cellules vivantes, offrant des informations sur les réponses cellulaires au stress mécanique. Cet article détaille une adaptation innovante du test d’aspiration par micropipette couplée à la fluorescence (fMPA). Le test fMPA introduit la capacité d’administrer des forces mécaniques précises tout en surveillant simultanément les processus de mécanotransduction des cellules vivantes médiés par les canaux ioniques. L’installation sophistiquée intègre une micropipette en verre borosilicaté de précision connectée à un réservoir d’eau finement régulé et à un système d’aspiration pneumatique, facilitant l’application d’une pression contrôlée avec des incréments allant jusqu'± 1 mmHg. Une amélioration significative est l’intégration de l’imagerie par épifluorescence, permettant l’observation et la quantification simultanées des changements morphologiques cellulaires et des flux de calcium intracellulaires pendant l’aspiration. Le test fMPA, grâce à sa combinaison synergique d’imagerie par épifluorescence et d’aspiration par micropipette, établit une nouvelle norme pour l’étude de la mécanodétection cellulaire dans des environnements mécaniquement difficiles. Cette approche multidimensionnelle est adaptable à diverses configurations expérimentales, fournissant des informations essentielles sur les mécanismes de mécanodétection unicellulaires.

Introduction

Les découvertes en cours dans le monde des comportements cellulaires ont accentué le rôle des stimuli mécaniques, tels que la tension, la contrainte de cisaillement des fluides, la compression et la rigidité du substrat, dans la dictature des activités cellulaires dynamiques telles que l’adhésion, la migration et la différenciation. Ces aspects mécanobiologiques sont d’une importance capitale pour élucider comment les cellules interagissent avec leur environnement physiologique et y répondent, ce qui a un impact sur divers processus biologiques ^1,2.

Au cours de la dernière décennie,....

Protocole

Ce protocole suit les directives du Comité d’éthique de la recherche sur l’être humain de l’Université de Sydney et a été approuvé par celui-ci. Le consentement éclairé des donateurs a été obtenu pour cette étude.

1. Isolement des globules rouges humains

REMARQUE : L’étape 1.1 doit être effectuée par un phlébotomiste formé selon un protocole approuvé par le comité d’examen institutionnel.

1. Prélevez 5 ml de sang de la veine cubitale médiane à l’aide d’une aiguille papillon de 19 G.
2. Transférez le sang prélevé dans un tube de 15 mL contenant de l’énoxaparine 1:200 pour empêcher la....

Discussion

Les tests d’aspiration par micropipette incarnent une méthodologie raffinée, déployant une modulation de pression substantielle, une orchestration spatiale exacte et un discernement temporel fiable pour sonder les subtilités profondes de la biomécanique cellulaire. Cette étude met particulièrement l’accent sur l’application de la MPMf en tant qu’outil crucial pour dévoiler les réponses mécanosensibles nuancées mises en évidence par les globules rouges sous divers stimuli. L’utilisation simultanée d.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system