Fluoreszenz-Mikropipetten-Aspirationsassay zur Untersuchung der Mechanosensorik roter Blutkörperchen

Zusammenfassung

Die Erforschung des zellulären Verhaltens unter mechanischer Belastung ist entscheidend für Fortschritte in der Zellmechanik und Mechanobiologie. Wir stellen die Fluoreszenz-Mikropipetten-Aspirationstechnik (fMPA) vor, eine neuartige Methode, die kontrollierte mechanische Stimulation mit einer umfassenden Analyse der intrazellulären Signalübertragung in einzelnen Zellen kombiniert. Diese Technik untersucht neue eingehende Studien der Mechanobiologie lebender Zellen.

Zusammenfassung

Mikropipetten-Aspirationsassays sind seit langem ein Eckpfeiler für die Untersuchung der Mechanik lebender Zellen und bieten Einblicke in die zellulären Reaktionen auf mechanischen Stress. In diesem Artikel wird eine innovative Anpassung des fluoreszenzgekoppelten Mikropipettenaspirationsassays (fMPA) beschrieben. Der fMPA-Assay bietet die Möglichkeit, präzise mechanische Kräfte zu verabreichen und gleichzeitig die durch Ionenkanäle vermittelten Mechanotransduktionsprozesse in lebenden Zellen zu überwachen. Der ausgeklügelte Aufbau umfasst eine präzisionsgefertigte Mikropipette aus Borosilikatglas, die mit einem fein regulierten Wasserreservoir und einem pneumatischen Absaugsystem verbunden ist und eine kontrollierte Druckanwendung mit Schritten von bis zu ± 1 mmHg ermöglicht. Eine wesentliche Verbesserung ist die Integration der Epi-Fluoreszenz-Bildgebung, die die gleichzeitige Beobachtung und Quantifizierung von zellmorphologischen Veränderungen und intrazellulären Kalziumflüssen während der Aspiration ermöglicht. Der fMPA-Assay setzt durch seine synergistische Kombination von Epifluoreszenz-Bildgebung und Mikropipettenaspiration einen neuen Standard für die Untersuchung der Zell-Mechanosensorik in mechanisch anspruchsvollen Umgebungen. Dieser facettenreiche Ansatz ist an verschiedene Versuchsaufbauten anpassbar und bietet wichtige Einblicke in die einzelligen Mechanosensormechanismen.

Einleitung

Die sich entfaltenden Entdeckungen in der Welt des zellulären Verhaltens haben die Rolle mechanischer Reize wie Spannung, Flüssigkeitsscherspannung, Kompression und Substratsteifigkeit bei der Bestimmung dynamischer zellulärer Aktivitäten wie Adhäsion, Migration und Differenzierung akzentuiert. Diese mechanobiologischen Aspekte sind von größter Bedeutung für die Aufklärung, wie Zellen mit ihrer physiologischen Umgebung interagieren und darauf reagieren, was sich auf verschiedene biologische Prozesse auswirkt ^1,2.

In den letzten zehn Jahren haben sich Mikropipetten-basierte Aspiratio....

Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Ethikausschusses für die Humanforschung der Universität Sydney und wurde von diesem genehmigt. Für diese Studie wurde von den Spendern eine Einverständniserklärung eingeholt.

1. Isolierung menschlicher Erythrozyten

HINWEIS: Schritt 1.1 sollte von einem ausgebildeten Phlebotomiker unter Verwendung eines vom Institutional Review Board genehmigten Protokolls durchgeführt werden.

1. Entnehmen Sie 5 ml Blut aus der mittleren Kubitalvene mit einer 19-G-Schmetterlingsnadel.
2. Übertragen Sie das gesammelte Blut in ein 15-ml-Röhrchen mit 1:200 Enox....

Diskussion

Mikropipetten-Aspirationsassays verkörpern eine verfeinerte Methodik, die eine erhebliche Druckmodulation, eine exakte räumliche Orchestrierung und ein zuverlässiges zeitliches Unterscheidungsvermögen einsetzt, um die tiefgreifenden Feinheiten der zellulären Biomechanik zu untersuchen. Diese Studie legt besonderen Wert auf die Anwendung von fMPA als entscheidendes Werkzeug zur Enthüllung der nuancierten mechanosensitiven Reaktionen, die von Erythrozyten unter unterschiedlichen Stimuli gezeigt werden. Die gleichzeit.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system