荧光微量移液器抽吸法研究红细胞机械传感

摘要

探索机械应力下的细胞行为对于细胞力学和机械生物学的进步至关重要。我们介绍了荧光微量移液器抽吸（fMPA）技术，这是一种将受控机械刺激与单细胞细胞内信号传导综合分析相结合的新方法。该技术研究了活细胞机械生物学的新深入研究。

摘要

长期以来，微量移液器抽吸法一直是研究活细胞力学的基石，为细胞对机械应力的反应提供了见解。本文详细介绍了荧光偶联微量移液器抽吸 （fMPA） 测定的创新应用。fMPA 检测引入了管理精确机械力的能力，同时监测由离子通道介导的活细胞机械转导过程。精密的装置包括一个精密设计的硼硅酸盐玻璃微量移液器，连接到一个精细调节的储水器和气动吸气系统，便于以± 1 mmHg的增量进行受控压力的应用。一个显著的改进是落射荧光成像的集成，允许在抽吸过程中同时观察和定量细胞形态变化和细胞内钙通量。fMPA检测通过其落射荧光成像与微量移液器抽吸的协同组合，为在具有挑战性的机械环境中研究细胞机械传感设定了新标准。这种多方面的方法适用于各种实验设置，为单细胞机械传感机制提供了重要的见解。

引言

细胞行为领域的不断发现强调了机械刺激（如张力、流体剪切应力、压缩和基质刚度）在决定动态细胞活动（如粘附、迁移和分化）中的作用。这些机械生物学方面对于阐明细胞如何与其生理环境相互作用并对其做出反应至关重要，从而影响各种生物过程 ^1,2。

在过去十年中，基于微量移液器的抽吸检测已成为研究各种细胞对机械刺激反应的多功能工具。该技术为单细胞水平上活细胞的内在机械特性提供了有价值的见解，包括细胞弹性模量、刚度和皮质张力。这些测定可以测量各种机械参数，例如细胞膜张力、施加在细胞膜上的压力和皮质张力（总结在表 1 中）。研究吸力丰富了我们对它们如何影响细胞功能和过程的理解，特别是在膜动力学领域，包括碎裂、伸长和萌芽 ^3,4。

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机械参数

描述

开创性方法

研究方案

该协议遵循悉尼大学人类研究伦理委员会的指南并已获得批准。本研究已获得捐赠者的知情同意。

1. 人红细胞分离

注意：步骤 1.1 应由训练有素的抽血师使用机构审查委员会批准的方案执行。

1. 使用 19 G 蝴蝶针从肘正中静脉抽取 5 mL 血液。
2. 将收集的血液转移到含有 1：200 依诺肝素的 15 mL 试管中以防止凝血。
3. 在 1 mL 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（C 缓冲液，pH = 8.5-9; 材料表）。
4. 将稀释的血液样品以900× g 离心1分钟以沉淀红细胞。 小心地倾析上清液而不干扰沉淀。
5. 用 1 mL C 缓冲液（材料表）洗涤 RBC 沉淀两次，每次以 900 × g 离心 1 分钟。
6. 随后，使用相同的离心条件用 1 mL Tyrode 缓冲液洗涤 RBC 沉淀 2 次，然后将最终沉淀重悬于 1 mL Tyrode 缓冲液中以获得洗涤后的原液 RBC 悬浮液。

2.钙指示剂负荷

1. 根据使用自动细胞计数器（材料表）....

讨论

微量移液器抽吸法体现了一种精细的方法，部署了大量的压力调节、精确的空间协调和可靠的时间辨别，以探索细胞生物力学的深刻复杂性。本研究特别强调 fMPA 作为揭示红细胞在不同刺激下表现出的细微机械敏感反应的关键工具的应用。同时使用明场和荧光信号可以对细胞现象进行多方面的探索，从而推进细胞内钙流入的实时监测和检测。这种方法为红细胞的复杂机械传感反应提供了综合见解?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system