Ensayo de aspiración con micropipeta de fluorescencia para investigar la mecanodetección de glóbulos rojos

Resumen

La exploración del comportamiento celular bajo estrés mecánico es fundamental para los avances en mecánica celular y mecanobiología. Presentamos la técnica de aspiración con micropipeta de fluorescencia (fMPA), un método novedoso que combina la estimulación mecánica controlada con un análisis exhaustivo de la señalización intracelular en células individuales. Esta técnica investiga nuevos estudios en profundidad de la mecanobiología de células vivas.

Resumen

Los ensayos de aspiración con micropipetas han sido durante mucho tiempo una piedra angular para la investigación de la mecánica de las células vivas, ya que ofrecen información sobre las respuestas celulares al estrés mecánico. En este artículo se detalla una adaptación innovadora del ensayo de aspiración de micropipetas acopladas a fluorescencia (fMPA). El ensayo fMPA introduce la capacidad de administrar fuerzas mecánicas precisas mientras se monitorean simultáneamente los procesos de mecanotransducción de células vivas mediados por canales iónicos. La sofisticada configuración incorpora una micropipeta de vidrio de borosilicato diseñada con precisión conectada a un depósito de agua finamente regulado y un sistema de aspiración neumática, lo que facilita la aplicación de presión controlada con incrementos tan refinados como ± 1 mmHg. Una mejora significativa es la integración de imágenes de epifluorescencia, que permite la observación y cuantificación simultáneas de los cambios morfológicos celulares y los flujos de calcio intracelular durante la aspiración. El ensayo fMPA, a través de su combinación sinérgica de imágenes de epifluorescencia con aspiración de micropipetas, establece un nuevo estándar para el estudio de la mecanodetección celular en entornos mecánicamente desafiantes. Este enfoque multifacético es adaptable a varias configuraciones experimentales, proporcionando información crítica sobre los mecanismos de mecanodetección de una sola célula.

Introducción

Los descubrimientos en desarrollo en el mundo de los comportamientos celulares han acentuado el papel de los estímulos mecánicos, como la tensión, el esfuerzo cortante del fluido, la compresión y la rigidez del sustrato, en el dictado de actividades celulares dinámicas como la adhesión, la migración y la diferenciación. Estos aspectos mecanobiológicos son de suma importancia para dilucidar cómo las células interactúan y responden a sus entornos fisiológicos, impactando en diversos procesos biológicos ^1,2.

Durante la última década, los ensayos de aspiración basados en micropipetas se....

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices y ha sido aprobado por el Comité de Ética de Investigación en Seres Humanos de la Universidad de Sydney. Se obtuvo el consentimiento informado de los donantes para este estudio.

1. Aislamiento de glóbulos rojos humanos

NOTA: El paso 1.1 debe ser realizado por un flebotomista capacitado utilizando un protocolo que haya sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional.

1. Extraiga 5 ml de sangre de la vena cubital mediana con una aguja de mariposa de 19 G.
2. Transfiera la sangre recolectada a un tubo de 15 ml que contenga enoxaparina 1:200 par....

Resultados

Para establecer los ensayos de aspiración de micropipetas, primero construimos una cámara celular personalizada que comprendía dos cuadrados de metal (cobre/aluminio) conectados por un mango. Se colocaron dos cubreobjetos de vidrio de tercer corte (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) para crear una cámara llena de 200 μL de glóbulos rojos suspendidos en el tampón de Tyrode. Después de introducir los glóbulos rojos en la cámara, se fijó una micropipeta de borosilicato a medida en un soporte y se colocó cuidadosamente de.......

Discusión

Los ensayos de aspiración con micropipetas incorporan una metodología refinada, que despliega una modulación de presión sustancial, una orquestación espacial exacta y un discernimiento temporal fiable para sondear las profundas complejidades de la biomecánica celular. Este estudio pone especial énfasis en la aplicación de fMPA como una herramienta crucial para revelar las respuestas mecanosensibles matizadas que muestran los glóbulos rojos bajo diferentes estímulos. El uso simultáneo de señales de campo claro.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system