نهج الاستنساخ السلس لبناء ناقل تعبير فيروس التكاثر الخنزير والجهاز التنفسي

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال إدخال مواقع تقييد مناسبة في نهاية 3 'من الإدراجات. يمكننا كتابة المتجه خطيا وربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر من خلال تقنية إعادة التركيب المتماثل.

Abstract

يعد بناء ناقلات التعبير الجيني مكونا مهما للعمل المختبري في علم الأحياء التجريبي. مع التطورات التقنية مثل Gibson Assembly ، يصبح بناء المتجهات بسيطا وفعالا نسبيا. ومع ذلك ، عندما لا يمكن تضخيم الجينوم الكامل لفيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) بسهولة عن طريق تفاعل بوليميراز متسلسل واحد (PCR) من cDNA ، أو يكون من الصعب الحصول على ناقل تعبير جيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل لإدخالات متعددة في المختبر ، فإن تقنية Gibson Assembly الحالية تفشل في تحقيق هذا الهدف.

وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تقسيم جينوم PRRSV إلى عدة أجزاء وإدخال مواقع تقييد مناسبة في التمهيدي العكسي للحصول على شظايا مضخمة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد انضمام جزء الحمض النووي السابق إلى الناقل بواسطة تقنية إعادة التركيب المتماثل ، اكتسب الناقل الجديد موقع انقسام إنزيم التقييد. ومن ثم، يمكننا تحويل المتجه خطيا باستخدام موقع انشقاق الإنزيم المضاف حديثا، وإدخال جزء الحمض النووي (DNA) التالي في اتجاه مجرى جزء الحمض النووي (DNA) في المنبع.

سيتم القضاء على موقع انقسام إنزيم التقييد الذي تم إدخاله في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي المنبع ، وسيتم إدخال موقع انشقاق جديد في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي في المصب. بهذه الطريقة، يمكننا ربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لبناء متجه تعبير PRRSV بنجاح وهي طريقة فعالة لتجميع عدد كبير من الأجزاء في متجه التعبير.

Introduction

كتقنية أساسية لبناء أدوات تجريبية قائمة على الحمض النووي للتعبير في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، يعد الاستنساخ الجزيئي مكونا مهما جدا في البيولوجيا التجريبية. يتضمن الاستنساخ الجزيئي أربع عمليات: الحصول على الحمض النووي المدرج ، وربط الإدخال في الناقل المناسب ، وتحويل الناقل المؤتلف إلى الإشريكية القولونية (E. coli) ، وتحديد المستنسخات الموجبة¹. حتى الآن ، تم اعتماد طرق متعددة للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد ^2,3 وإعادة التركيب بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ^4,5,6

Protocol

1. إعداد قالب الجين PRRSV

1. قم بإذابة مخزون الفيروس في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
2. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم واخلطه جيدا. احتضان لمدة 3 دقائق.
3. يطرد الخليط لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: ينقسم الخليط إلى ثلاث مراحل ، وهي مرحلة مائية عديمة اللون ، وطور بيني ، ومرحلة الفينول كلوروفورم الحمراء.
4. ماصة التخلص التدريجي المائي عديم اللون ونقله إلى أنبوب جديد.
5. امزج الطور المائي جيدا مع 0.5 مل من الأيزوبروبانول واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
6. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12000 × جم عند 4 درجات مئو....

النتائج

في هذه الورقة ، نقدم نظام إعادة التركيب في المختبر لتجميع وإصلاح جزيئات الحمض النووي المتداخلة باستخدام التمهيدي العكسي عبر مواقع التقييد التي يتم إدخالها باستمرار (الشكل 1 ب). هذا النظام هو إجراء بسيط وفعال يشمل إعداد المتجه الخطي وشظايا الإدراج التي تحتوي على نتوءا?.......

Discussion

تقنية تجميع جيبسون هي طريقة استنساخ جزيئي قائمة على إعادة التركيب في المختبر لتجميع شظايا الحمض النووي⁸. تتيح هذه الطريقة تجميع شظايا متعددة من الحمض النووي في بلازميد دائري في تفاعل متساوي الحرارة أحادي الأنبوب. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات التي تحول دون تقنية Gibson Assembly هي .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent