A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال إدخال مواقع تقييد مناسبة في نهاية 3 'من الإدراجات. يمكننا كتابة المتجه خطيا وربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر من خلال تقنية إعادة التركيب المتماثل.
يعد بناء ناقلات التعبير الجيني مكونا مهما للعمل المختبري في علم الأحياء التجريبي. مع التطورات التقنية مثل Gibson Assembly ، يصبح بناء المتجهات بسيطا وفعالا نسبيا. ومع ذلك ، عندما لا يمكن تضخيم الجينوم الكامل لفيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) بسهولة عن طريق تفاعل بوليميراز متسلسل واحد (PCR) من cDNA ، أو يكون من الصعب الحصول على ناقل تعبير جيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل لإدخالات متعددة في المختبر ، فإن تقنية Gibson Assembly الحالية تفشل في تحقيق هذا الهدف.
وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تقسيم جينوم PRRSV إلى عدة أجزاء وإدخال مواقع تقييد مناسبة في التمهيدي العكسي للحصول على شظايا مضخمة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد انضمام جزء الحمض النووي السابق إلى الناقل بواسطة تقنية إعادة التركيب المتماثل ، اكتسب الناقل الجديد موقع انقسام إنزيم التقييد. ومن ثم، يمكننا تحويل المتجه خطيا باستخدام موقع انشقاق الإنزيم المضاف حديثا، وإدخال جزء الحمض النووي (DNA) التالي في اتجاه مجرى جزء الحمض النووي (DNA) في المنبع.
سيتم القضاء على موقع انقسام إنزيم التقييد الذي تم إدخاله في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي المنبع ، وسيتم إدخال موقع انشقاق جديد في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي في المصب. بهذه الطريقة، يمكننا ربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لبناء متجه تعبير PRRSV بنجاح وهي طريقة فعالة لتجميع عدد كبير من الأجزاء في متجه التعبير.
كتقنية أساسية لبناء أدوات تجريبية قائمة على الحمض النووي للتعبير في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، يعد الاستنساخ الجزيئي مكونا مهما جدا في البيولوجيا التجريبية. يتضمن الاستنساخ الجزيئي أربع عمليات: الحصول على الحمض النووي المدرج ، وربط الإدخال في الناقل المناسب ، وتحويل الناقل المؤتلف إلى الإشريكية القولونية (E. coli) ، وتحديد المستنسخات الموجبة1. حتى الآن ، تم اعتماد طرق متعددة للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد 2,3 وإعادة التركيب بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل 4,5,6
1. إعداد قالب الجين PRRSV
في هذه الورقة ، نقدم نظام إعادة التركيب في المختبر لتجميع وإصلاح جزيئات الحمض النووي المتداخلة باستخدام التمهيدي العكسي عبر مواقع التقييد التي يتم إدخالها باستمرار (الشكل 1 ب). هذا النظام هو إجراء بسيط وفعال يشمل إعداد المتجه الخطي وشظايا الإدراج التي تحتوي على نتوءا?.......
تقنية تجميع جيبسون هي طريقة استنساخ جزيئي قائمة على إعادة التركيب في المختبر لتجميع شظايا الحمض النووي8. تتيح هذه الطريقة تجميع شظايا متعددة من الحمض النووي في بلازميد دائري في تفاعل متساوي الحرارة أحادي الأنبوب. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات التي تحول دون تقنية Gibson Assembly هي .......
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
تم دعم هذا العمل من خلال الدعم المالي لصناديق بدء أبحاث الدكتوراه المقدمة من جامعة غرب الصين للمعلمين (رقم 20E059).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved