A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال إدخال مواقع تقييد مناسبة في نهاية 3 'من الإدراجات. يمكننا كتابة المتجه خطيا وربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر من خلال تقنية إعادة التركيب المتماثل.

Abstract

يعد بناء ناقلات التعبير الجيني مكونا مهما للعمل المختبري في علم الأحياء التجريبي. مع التطورات التقنية مثل Gibson Assembly ، يصبح بناء المتجهات بسيطا وفعالا نسبيا. ومع ذلك ، عندما لا يمكن تضخيم الجينوم الكامل لفيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) بسهولة عن طريق تفاعل بوليميراز متسلسل واحد (PCR) من cDNA ، أو يكون من الصعب الحصول على ناقل تعبير جيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل لإدخالات متعددة في المختبر ، فإن تقنية Gibson Assembly الحالية تفشل في تحقيق هذا الهدف.

وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تقسيم جينوم PRRSV إلى عدة أجزاء وإدخال مواقع تقييد مناسبة في التمهيدي العكسي للحصول على شظايا مضخمة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد انضمام جزء الحمض النووي السابق إلى الناقل بواسطة تقنية إعادة التركيب المتماثل ، اكتسب الناقل الجديد موقع انقسام إنزيم التقييد. ومن ثم، يمكننا تحويل المتجه خطيا باستخدام موقع انشقاق الإنزيم المضاف حديثا، وإدخال جزء الحمض النووي (DNA) التالي في اتجاه مجرى جزء الحمض النووي (DNA) في المنبع.

سيتم القضاء على موقع انقسام إنزيم التقييد الذي تم إدخاله في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي المنبع ، وسيتم إدخال موقع انشقاق جديد في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي في المصب. بهذه الطريقة، يمكننا ربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لبناء متجه تعبير PRRSV بنجاح وهي طريقة فعالة لتجميع عدد كبير من الأجزاء في متجه التعبير.

Introduction

كتقنية أساسية لبناء أدوات تجريبية قائمة على الحمض النووي للتعبير في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، يعد الاستنساخ الجزيئي مكونا مهما جدا في البيولوجيا التجريبية. يتضمن الاستنساخ الجزيئي أربع عمليات: الحصول على الحمض النووي المدرج ، وربط الإدخال في الناقل المناسب ، وتحويل الناقل المؤتلف إلى الإشريكية القولونية (E. coli) ، وتحديد المستنسخات الموجبة1. حتى الآن ، تم اعتماد طرق متعددة للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد 2,3 وإعادة التركيب بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل 4,5,6

Protocol

1. إعداد قالب الجين PRRSV

  1. قم بإذابة مخزون الفيروس في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  2. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم واخلطه جيدا. احتضان لمدة 3 دقائق.
  3. يطرد الخليط لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ينقسم الخليط إلى ثلاث مراحل ، وهي مرحلة مائية عديمة اللون ، وطور بيني ، ومرحلة الفينول كلوروفورم الحمراء.
  4. ماصة التخلص التدريجي المائي عديم اللون ونقله إلى أنبوب جديد.
  5. امزج الطور المائي جيدا مع 0.5 مل من الأيزوبروبانول واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12000 × جم عند 4 درجات مئو....

النتائج

في هذه الورقة ، نقدم نظام إعادة التركيب في المختبر لتجميع وإصلاح جزيئات الحمض النووي المتداخلة باستخدام التمهيدي العكسي عبر مواقع التقييد التي يتم إدخالها باستمرار (الشكل 1 ب). هذا النظام هو إجراء بسيط وفعال يشمل إعداد المتجه الخطي وشظايا الإدراج التي تحتوي على نتوءا?.......

Discussion

تقنية تجميع جيبسون هي طريقة استنساخ جزيئي قائمة على إعادة التركيب في المختبر لتجميع شظايا الحمض النووي8. تتيح هذه الطريقة تجميع شظايا متعددة من الحمض النووي في بلازميد دائري في تفاعل متساوي الحرارة أحادي الأنبوب. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات التي تحول دون تقنية Gibson Assembly هي .......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال الدعم المالي لصناديق بدء أبحاث الدكتوراه المقدمة من جامعة غرب الصين للمعلمين (رقم 20E059).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

References

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PRRSV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved