JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال إدخال مواقع تقييد مناسبة في نهاية 3 'من الإدراجات. يمكننا كتابة المتجه خطيا وربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر من خلال تقنية إعادة التركيب المتماثل.

Abstract

يعد بناء ناقلات التعبير الجيني مكونا مهما للعمل المختبري في علم الأحياء التجريبي. مع التطورات التقنية مثل Gibson Assembly ، يصبح بناء المتجهات بسيطا وفعالا نسبيا. ومع ذلك ، عندما لا يمكن تضخيم الجينوم الكامل لفيروس متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRSV) بسهولة عن طريق تفاعل بوليميراز متسلسل واحد (PCR) من cDNA ، أو يكون من الصعب الحصول على ناقل تعبير جيني كامل الطول عن طريق إعادة التركيب المتماثل لإدخالات متعددة في المختبر ، فإن تقنية Gibson Assembly الحالية تفشل في تحقيق هذا الهدف.

وبالتالي ، فإننا نهدف إلى تقسيم جينوم PRRSV إلى عدة أجزاء وإدخال مواقع تقييد مناسبة في التمهيدي العكسي للحصول على شظايا مضخمة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد انضمام جزء الحمض النووي السابق إلى الناقل بواسطة تقنية إعادة التركيب المتماثل ، اكتسب الناقل الجديد موقع انقسام إنزيم التقييد. ومن ثم، يمكننا تحويل المتجه خطيا باستخدام موقع انشقاق الإنزيم المضاف حديثا، وإدخال جزء الحمض النووي (DNA) التالي في اتجاه مجرى جزء الحمض النووي (DNA) في المنبع.

سيتم القضاء على موقع انقسام إنزيم التقييد الذي تم إدخاله في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي المنبع ، وسيتم إدخال موقع انشقاق جديد في نهاية 3 'من جزء الحمض النووي في المصب. بهذه الطريقة، يمكننا ربط أجزاء الحمض النووي (DNA) بالمتجه واحدا تلو الآخر. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لبناء متجه تعبير PRRSV بنجاح وهي طريقة فعالة لتجميع عدد كبير من الأجزاء في متجه التعبير.

Introduction

كتقنية أساسية لبناء أدوات تجريبية قائمة على الحمض النووي للتعبير في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، يعد الاستنساخ الجزيئي مكونا مهما جدا في البيولوجيا التجريبية. يتضمن الاستنساخ الجزيئي أربع عمليات: الحصول على الحمض النووي المدرج ، وربط الإدخال في الناقل المناسب ، وتحويل الناقل المؤتلف إلى الإشريكية القولونية (E. coli) ، وتحديد المستنسخات الموجبة1. حتى الآن ، تم اعتماد طرق متعددة للانضمام إلى جزيئات الحمض النووي باستخدام إنزيمات التقييد 2,3 وإعادة التركيب بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل 4,5,6. إعادة التركيب المتماثل ، والمعروفة باسم تقنية الاستنساخ غير الملحومة ، هي مجموعة من طرق الاستنساخ ، والتي تسمح بإدخال جزء أو أكثر من أجزاء الحمض النووي في ناقل مستقل عن التسلسل وبدون ندوب. تتضمن هذه التقنية الاستنساخ المستقل عن التسلسل والربط (SLIC) ، ومستخلص استنساخ الربط السلس (SLiCE) ، و In-Fusion ، و Gibson Assembly. يستخدم إكسونوكلياز لتحلل حبلا واحدا من الإدخال ومتجها لتوليد نهايات متماسكة ، وإما في إصلاح الجسم الحي أو في إعادة التركيب في المختبر لربط الإدخال تساهميا بالناقل عن طريق تكوين روابط فوسفاتية ثنائية الإستر. تعد القدرة على ربط إدراج واحد بناقل في أي تسلسل دون أي ندوب أمرا جذابا للغاية. علاوة على ذلك ، تتمتع التكنولوجيا بالقدرة على ربط 5-10 أجزاء بترتيب محدد مسبقا دون قيود على التسلسل.

باعتبارها واحدة من العديد من تقنيات الحمض النووي المؤتلف ، فإن تقنية Gibson Assembly ، وهي حاليا أكثر طرق الاستنساخ فعالية 7,8 ، هي طريقة قوية وأنيقة قائمة على exonuclease لتجميع جزء واحد أو عدة أجزاء من الحمض النووي الخطي بسلاسة. يتم إجراء تفاعل Gibson Assembly تحت ظروف متساوية الحرارة باستخدام خليط من ثلاثة إنزيمات ، وهي 5 'exonuclease ، و polymerase عالي الدقة ، و ligase DNA قابل للحرارة. تساهم الأجزاء المتدلية أحادية الخيط 3 بوصات التي تم إنشاؤها بواسطة exonuclease 5'-3 في تلدين الأجزاء التي تشترك في التكامل في أحد طرفيها. يملأ إنزيم البوليميراز عالي الدقة الفجوات في المناطق أحادية الشريط الملدنة بشكل فعال عن طريق إضافة dNTPs ، ويقوم إنزيم ربط الحمض النووي القابل للحرارة بإغلاق الشقوق لتشكيل جزيئات الحمض النووي المشتركة8. ومن ثم ، فقد تم استخدام هذه الطريقة التقنية على نطاق واسع لبناء ناقلات التعبير الجيني.

متلازمة الخنازير التناسلية والجهاز التنفسي (PRRS) هي مرض فيروسي يؤدي إلى ضعف تناسلي وفشل تنفسي في الخنازير بسبب PRRSV في أي عمر9. تتجلى المتلازمة في الحمى وفقدان الشهية والالتهاب الرئوي والخمول والاكتئاب وضيق التنفس. علاوة على ذلك ، لوحظت علامات سريرية ، بما في ذلك تغير لون الأذنين باللون الأحمر / الأزرق ، في بعض الأوبئة. كعضو في عائلة فيروس الشرايين ، ينتقل PRRSV على نطاق واسع إلى البلدان المنتجة لحم الخنزير عن طريق الاتصال المباشر وتبادل السوائل ، بما في ذلك البول واللبأ واللعاب. بسبب انتشار PRRSV في الولايات المتحدة ، قدرت الخسائر الاقتصادية الإجمالية لصناعة لحم الخنزير بحوالي 664 مليون دولار سنويا ، بناء على حجم تكاثر 5.8 مليون بذر و 110 مليون خنزير10,11. يظهر تقرير خدمة فحص صحة الحيوان والنبات أن 49.8٪ من الخنازير غير المحصنة تظهر وجود PRRSV في المصل12 وأن المستويات المنخفضة من PRRSV في الخنازير المصابة تفرز من خلال اللعاب وإفرازات الأنف والبول والبراز13. تم تنفيذ استراتيجيات متعددة للسيطرة على انتشار PRRSV14،15،16. بالإضافة إلى إجراءات التخلص من السكان غير الراضين تماما عن الفيروس أو تحسين السلامة البيولوجية وإدارتها ، فإن إعطاء اللقاحات هو وسيلة فعالة للسيطرة على PRRS.

PRRSV هو فيروس RNA مغلف ، مفرد تقطعت به السبل ، ذو إحساس إيجابي يبلغ طوله حوالي 15 كيلو قاعدة (kb). يتكون جينوم PRRSV من 10 إطارات قراءة مفتوحة على الأقل (ORFs) ، ومنطقة قصيرة غير مترجمة 5 بوصات (5 'UTR) ، وذيل بولي (A) عند النهاية 3 '(الشكل 1A) 17. جينوم فيروس الحمض النووي الريبي السلبي الذي تقطعت به السبل غير معدي في حين أن الجينوم من فيروسات الحمض النووي الريبي الموجبة التي تقطعت بها السبل معدي. هناك استراتيجيتان رئيسيتان لنقل الحمض النووي الريبي والحمض النووي لتوليد ذرية الفيروس18. ومع ذلك ، فإن استنساخ الجزء الكامل الطول المقابل لجينوم الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية لبناء المستنسخة المعدية. نظرا للطبيعة الطويلة والمعقدة لجينوم PRRSV ، لا يمكن الحصول على الجينوم الكامل الطول بسهولة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل مرة واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن التوليف الاصطناعي لجينات PRRSV هو حل فعال ، إلا أن تخليق الشظايا الطويلة غالبا ما يكون مكلفا. ومن ثم ، للحصول على متجه التعبير الكامل PRRSV ، حاولنا إنشائه بواسطة طريقة إعادة التركيب المتماثل للإدخالات المتعددة19,20. لسوء الحظ ، لم نتمكن من الحصول على ناقل التعبير الجيني كامل الطول. لذلك ، في هذه الدراسة ، أضفنا مواقع تقييد مناسبة إلى التمهيدي العكسي وحصلنا بنجاح على متجه التعبير pVAX1-PRRSV من خلال عدة جولات من تفاعلات إعادة التركيب المتماثلة. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الطريقة أيضا تحقيق حذف أو طفرة في الجينات المستهدفة وربط عدد كبير من شظايا الحمض النووي بكفاءة بناقل التعبير.

Protocol

1. إعداد قالب الجين PRRSV

  1. قم بإذابة مخزون الفيروس في 1 مل من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
  2. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم واخلطه جيدا. احتضان لمدة 3 دقائق.
  3. يطرد الخليط لمدة 15 دقيقة عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: ينقسم الخليط إلى ثلاث مراحل ، وهي مرحلة مائية عديمة اللون ، وطور بيني ، ومرحلة الفينول كلوروفورم الحمراء.
  4. ماصة التخلص التدريجي المائي عديم اللون ونقله إلى أنبوب جديد.
  5. امزج الطور المائي جيدا مع 0.5 مل من الأيزوبروبانول واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يحتوي الجزء السفلي من الأنبوب على راسب RNA أبيض.
  7. استخدم ماصة صغيرة للتخلص من طاف الأنبوب.
  8. أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ لإعادة تعليق الحبيبات والدوامة لفترة وجيزة.
  9. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 7500 × جم عند 4 درجات مئوية. استخدم ماصة صغيرة للتخلص من طاف الأنبوب.
  10. جفف الحمض النووي الريبي لمدة 5 دقائق ، وأضف 20-50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي ، واخلطه جيدا.
  11. المضي قدما في إجراء النسخ العكسي ؛ قم بإعداد التفاعلات لإجراء النسخ العكسي كما هو موضح في الجدول 1.
    ملاحظة: لضمان النسخ العكسي الناجح ، استخدم قوالب RNA عالية الجودة.
  12. استخدم cDNA الناتج لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو قم بتخزينه في -20 درجة مئوية.

2. تصميم التمهيدي PCR

  1. تصميم التمهيدي الأمامي
    1. افتح البرنامج واختر ملف DNA جديد.
    2. الصق تسلسل الجينات PRRSV (GenBank: FJ548852.1) من NCBI في البرنامج. انقر فوق موافق لإنشاء ملفات التسلسل.
    3. تحليل التسلسل ووضع علامة على تقاطعات الشظية. تصميم التمهيدي تسلسل محدد إلى الأمام من الأجزاء. في معظم الحالات ، تتراوح درجة حرارة الانصهار المفضلة (Tm) بين 55 درجة مئوية و 62 درجة مئوية ، ومحتوى GC هو 40-60٪.
    4. انقر فوق التمهيدي واختر إضافة التمهيدي.
    5. الصق التسلسل المحدد وأضف تسلسلات متداخلة من المتجه إلى أول 5 نيوكليوتيدات من التمهيدي للتسلسل المحدد. بالقرب من كل تقاطع ، اختر 20-40 نقطة أساس لتكون بمثابة منطقة تداخل بين الشظيتين المتجاورتين.
    6. قم بتسمية التمهيدي الأمامي الذي يحتوي على الأجزاء المتدلية والتسلسل المحدد (انظر الشكل التكميلي S1).
    7. انقر فوق إضافة التمهيدي إلى القالب.
  2. تصميم التمهيدي العكسي
    1. تحليل التسلسل ووضع علامة على تقاطعات الأجزاء في البرنامج. تصميم التمهيدي تسلسل محدد عكسي للشظايا.
    2. انقر فوق التمهيدي واختر إضافة التمهيدي.
    3. الصق التسلسل المحدد وأضف موقع التقييد إلى أول 5 نوكليوتيدات من التمهيدي للتسلسل المحدد.
      ملاحظة: يجب أن تكون مواقع التقييد المضافة غائبة عن جزء الإدراج والمتجه باستثناء مواقع الاستنساخ المتعددة.
    4. أضف 20-40 bp تسلسلات متدلية من المتجهات إلى أول 5 'نيوكليوتيد من موقع التقييد.
    5. قم بتسمية التمهيدي العكسي الذي يحتوي على الأجزاء المتدلية والتسلسل المحدد (انظر الشكل التكميلي S1).
    6. انقر فوق إضافة التمهيدي إلى القالب.

3. PCR لتضخيم الشظايا

  1. إعداد ستة تفاعلات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الفردية (الجدول 2): بالنسبة للجزء 1 ، استخدم البادئات P1 و P2 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 2 ، استخدم البادئات P3 و P4 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 3 ، استخدم البادئات P5 و P6 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 4 ، استخدم البادئات P7 و P8 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 5 ، استخدم الاشعال P9 و P10 ؛ واستخدم البادئات P11 و P12 لتضخيم الجزء 6 (انظر الشكل التكميلي S2).
    ملاحظة: قم بإذابة كل مكون وخلطه وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة قبل الاستخدام.
  2. قم بتشغيل PCR باستخدام بروتوكول الخطوات الثلاث في الجدول 2.
  3. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي 6x إلى 5 ميكرولتر من منتج PCR ، وامزج المحتويات وطردها مركزيا لفترة وجيزة.
  4. تحليل العينات باستخدام 1 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي.

4. تنقية شظايا PCR

ملاحظة: يعد تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من هلام باستخدام مجموعة استخراج الهلام (انظر جدول المواد) أمرا مهما لبناء النواقل.

  1. أضف 9 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي 6x إلى 45 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وامزج المحتويات وطردها لفترة وجيزة.
  2. أداء 1 ٪ هلام الأغاروز / goldview الكهربائي لفصل شظايا الحمض النووي.
    ملاحظة: لا تقم بإعادة استخدام المخزن المؤقت لتشغيل TAE لأن قيمة الأس الهيدروجيني الخاصة به ستؤثر على استعادة جزء الحمض النووي.
  3. عند الفصل الكافي للعصابات ، استخدم مشرطا حادا لاستئصال أشرطة الحمض النووي بعناية.
    ملاحظة: قلل من حجم شريحة الجل عن طريق تقليم الأغاروز الزائد.
  4. قم بوزن شريحة الهلام في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مل ، وأضف حجما متساويا من المخزن المؤقت للربط إلى شريحة الهلام (على سبيل المثال ، 0.3 مل إلى شريحة 0.3 جم) ، واحتضانها عند 60 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  5. أدخل عمودا صغيرا في أنبوب تجميع سعة 2 مل. أضف 700 ميكرولتر من محلول الحمض النووي / الأغاروز من الخطوة 4.4 إلى العمود المصغر.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 10000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح وأعد استخدام أنبوب التجميع.
  7. أضف 300 ميكرولتر من عازلة الربط وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح وأعد استخدام أنبوب التجميع.
  8. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المرشح وأعد استخدام أنبوب التجميع.
  9. أدر العمود الصغير الفارغ لمدة 2 دقيقة بأقصى سرعة لتجفيف مصفوفة العمود. ضع العمود الصغير في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل.
  10. أضف 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات مباشرة إلى مركز غشاء العمود واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. أجهزة الطرد المركزي بسرعة 13000 × غرام لمدة 1 دقيقة.
  11. قم بتخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.

5. إعداد ناقل خطي

ملاحظة: بعد تحضير البلازميد ، يمكن استخدام الإنزيمات المختارة لقطعه. الهضم الطويل أو هضم الإنزيم المزدوج أمر بالغ الأهمية لضمان هضم جميع الحمض النووي. سيؤدي ذلك إلى تقليل عدد المستنسخة الإيجابية الكاذبة في التجارب اللاحقة.

  1. pVAX1 الخطي
    1. تحضير خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب الموضح (الجدول 3).
      ملاحظة: يجب إضافة حجم الماء للحفاظ على حجم التفاعل الكلي المشار إليه. هنا ، تم هضم 1 ميكروغرام من البلازميد مع الإنزيمات في خليط التفاعل. اعتمادا على تركيز البلازميد ، يمكن ضبط حجم البلازميد في خليط التفاعل.
    2. تخلط بلطف. ثم تدور لأسفل. احتضان في 37 درجة مئوية في كتلة حرارة أو ترموستات الماء لمدة 60 دقيقة.
    3. قم بإجراء تنقية الجل على غرار تنقية شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم 4 باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر جدول المواد).
  2. pVAX1-F1 الخطي
    ملاحظة: pVAX1-F1 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من الجولة الأولى من pVAX1 (NdeI و HindIII) وإعادة تركيب الجزء 1. pVAX1-F2 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F1 (NdeI) وإعادة تركيب الجزء 2. pVAX1-F3 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F2 (NdeI) وإعادة تركيب الجزء 3. pVAX1-F4 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F3 (NdeI) وإعادة تركيب الجزء 4. pVAX1-F5 هو المتجه الذي تم الحصول عليه من جولة pVAX1-F4 (EcoRV و NtoI) وإعادة تركيب الجزء 5.
    1. لكل متجه ، تحضير خليط التفاعل بشكل منفصل في درجة حرارة الغرفة بالترتيب الموضح (الجدول 3).
    2. تخلط بلطف. ثم تدور لأسفل. احتضان في 37 درجة مئوية في كتلة حرارة أو ترموستات الماء لمدة 60 دقيقة.
    3. قم بإجراء تنقية الجل على غرار تنقية شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل في القسم 4 باستخدام مجموعة استخراج الجل (انظر جدول المواد).

6. الاستنساخ الفرعي إلى متجه جديد

ملاحظة: يمكن تحقيق كفاءة استنساخ جيدة عند استخدام 50-200 نانوغرام من المتجهات والإدخالات.

  1. قم بإعداد تفاعل الاستنساخ والتجميع السلس ل ExonArt (الجدول 4). اضبط حجم التفاعل الكلي على 10 ميكرولتر باستخدام H2O منزوع الأيونات المعقم واخلطه.
  2. احتضان التفاعل في دورة حرارية لمدة 15-60 دقيقة عند 50 درجة مئوية. تخزين العينات على الجليد.
    ملاحظة: قد يؤدي تمديد الحضانة حتى 60 دقيقة إلى تحسين كفاءة التجميع.
  3. ذوبان DH5α الخلايا المختصة كيميائيا على الجليد.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من منتج التجميع إلى الخلايا المختصة ؛ ثم اخلطي برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
  5. ضع الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  6. صدمة حرارية عند 45 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ونقل الأنابيب على الجليد لمدة 3 دقائق.
  7. أضف 900 ميكرولتر من وسيط SOC إلى الأنبوب.
  8. هز الأنبوب عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في حاضنة اهتزاز 37 درجة مئوية.
  9. الطرد المركزي رد فعل التحول في 6000 × غرام لمدة 2 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط SOC الطازج.
  10. انشر معلق الخلية المحولة على لوحة LB منفصلة مع 50 ميكروغرام / مل كاناميسين.
  11. احتضان جميع الأطباق طوال الليل على درجة حرارة 37 درجة مئوية. اختر مستعمرات فردية معزولة من كل لوحة تجريبية.

7. تحليل المحولات

  1. اختر ثماني مستعمرات في 20 ميكرولتر من وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين.
  2. قم بإعداد تفاعل PCR للمستعمرة وقم بتشغيل PCR (الجدول 5).
    ملاحظة: بالنسبة لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة للجزء 1 ، استخدم البادئات P1 و P2 (انظر الملف التكميلي 1) ؛ بالنسبة للجزء 2 ، استخدم البادئين P3 و P4 (انظر الملف التكميلي 1) ؛ بالنسبة للجزء 3 ، استخدم البادئين P5 و P6 (انظر الملف التكميلي 1) ؛ بالنسبة للجزء 4 ، استخدم البادئات P7 و P8 (انظر الشكل التكميلي S2) ؛ بالنسبة للجزء 5 ، استخدم الاشعال P9 و P10 ؛ واستخدم البادئات P11 و P12 للكشف عن الجزء 6 (انظر الشكل التكميلي S2).
  3. أضف 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الحمض النووي 6x إلى 5 ميكرولتر من منتج PCR ، وامزج المحتويات وطردها لفترة وجيزة.
  4. تحليل النتائج باستخدام 1 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي.
  5. اختر مستعمرة موجبة واحدة في 5 مل من وسط LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاناميسين وتنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
  6. احصل على البلازميد باستخدام مجموعة مصغرة من الحمض النووي البلازميد (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  7. تصور النتائج باستخدام 1 ٪ هلام الأغاروز الكهربائي.

النتائج

في هذه الورقة ، نقدم نظام إعادة التركيب في المختبر لتجميع وإصلاح جزيئات الحمض النووي المتداخلة باستخدام التمهيدي العكسي عبر مواقع التقييد التي يتم إدخالها باستمرار (الشكل 1 ب). هذا النظام هو إجراء بسيط وفعال يشمل إعداد المتجه الخطي وشظايا الإدراج التي تحتوي على نتوءا?...

Discussion

تقنية تجميع جيبسون هي طريقة استنساخ جزيئي قائمة على إعادة التركيب في المختبر لتجميع شظايا الحمض النووي8. تتيح هذه الطريقة تجميع شظايا متعددة من الحمض النووي في بلازميد دائري في تفاعل متساوي الحرارة أحادي الأنبوب. ومع ذلك ، فإن إحدى العقبات التي تحول دون تقنية Gibson Assembly هي ...

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال الدعم المالي لصناديق بدء أبحاث الدكتوراه المقدمة من جامعة غرب الصين للمعلمين (رقم 20E059).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

References

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500 (2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45 (2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410 (2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PRRSV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved