猪繁殖与呼吸综合征病毒表达载体构建的无缝克隆方法

摘要

在这里，我们提出了一种通过在插入片段的 3' 末端引入合适的限制性位点来获得 pVAX1-PRRSV 表达载体的方案。我们可以通过同源重组技术将载体线性化，并将 DNA 片段一一连接到载体上。

摘要

基因表达载体的构建是实验生物学实验室工作的重要组成部分。随着 Gibson Assembly 等技术的进步，载体构建变得相对简单和高效。然而，当猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV） 的全长基因组不能轻易地通过 cDNA 的单个聚合酶链反应 （PCR） 扩增，或者难以在 体外通过多个插入片段的同源重组获得全长基因表达载体时，目前的 Gibson Assembly 技术无法实现这一目标。

因此，我们的目标是将 PRRSV 基因组分成几个片段，并将适当的限制性位点引入反向引物以获得 PCR 扩增片段。通过同源重组技术将以前的 DNA 片段连接到载体中后，新载体获得了限制性内切酶切割位点。因此，我们可以使用新添加的酶切割位点对载体进行线性化，并在上游 DNA 片段的下游引入下一个 DNA 片段。

上游 DNA 片段 3' 端引入的限制性内切酶切割位点将被消除，新的切割位点将被引入下游 DNA 片段的 3' 端。通过这种方式，我们可以将 DNA 片段一一连接到载体上。该方法适用于成功构建 PRRSV 表达载体，是将大量片段组装到表达载体中的有效方法。

引言

分子克隆是构建基于 DNA 的原核细胞和真核细胞表达实验工具的重要技术，是实验生物学中非常重要的组成部分。分子克隆涉及四个过程：获取插入片段 DNA、将插入片段连接到适当的载体中、将重组载体转化成大肠杆菌（大肠杆菌）以及鉴定阳性克隆¹。到目前为止，已经采用了多种方法通过使用限制性内切酶 ^2,3 和 PCR 介导的重组 ^4,5,6 来连接 DNA 分子。同源重组，称为无缝克隆技术，是一组克隆方法，允许将一个或多个 DNA 片段不依赖于序列且无疤痕地插入载体中。该技术包括不依赖序列和连接的克隆 （SLIC）、无缝连接克隆提取物 （SLiCE）、In-Fusion 和 Gibson 组装。它采用核酸外切酶降解插入片段的一条链，利用载体生成内聚末端，并通过体内修复或体外重组通过形成磷酸二酯键将插入片段共价连接到载体上。将单个插入片段连接到任何序列的载体而没有任何疤痕的能力非常有吸引力。此外，该技术能够按预定顺序连接 5-10 个片段，而不受序列限制。

作为众多重组 ....

研究方案

1. PRRSV 基因模板的制备

1. 在 1 mL RNA 提取试剂中解冻病毒原液（参见 材料表）。
2. 加入 0.2 mL 氯仿并充分混合。孵育 3 分钟。
3. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心混合物 15 分钟。
   注：混合物分为三个相，即无色水相、间相和红色苯酚-氯仿相。
4. 吸出无色水相并将其转移到新管中。
5. 将水相与 0.5 mL 异丙醇充分混合，并在 4 °C 下孵育 10 分钟。
6. 在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 10 分钟。
   注：试管底部有白色 RNA 沉淀物。
7. 使用微量移液器丢弃试管的上清液。
8. 加入 1 mL 75% 乙醇以重悬沉淀并短暂涡旋。
9. 在 4 °C 下以 7,500 × g 离心 5 分钟。 使用微量移液器丢弃试管的上清液。
10. 将 RNA 干燥 5 分钟，加入 20-50 μL 不含 RNase 的水以重悬 RNA，并充分混合。
11. 继续进行逆转录;设置反应以进行逆转录，如 表 1 所示。
    注：为确保逆转录成功，请使用高质量的 RNA 模板。
12. 使用所得的 cDNA 进行 PCR 或将其储存在 -....

讨论

Gibson 组装技术是一种基于 体外 重组的分子克隆方法，用于组装 DNA 片段⁸。该方法能够在单管等温反应中将多个 DNA 片段组装成一个环状质粒。然而，Gibson Assembly 技术的障碍之一是从 cDNA 获取长片段。由于多种原因，长片段难以准确扩增。例如，引物在长时间延伸时更容易错配，cDNA 质量可能不佳，或者富含 GC 的区域会阻止 DNA 聚合。当使用 PCR 无法从 cDNA 中轻易获得全长.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent