Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüs Ekspresyon Vektör Yapısı için Kesintisiz Bir Klonlama Yaklaşımı

Özet

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Özet

Gen ekspresyon vektörlerinin inşası, deneysel biyolojide laboratuvar çalışmalarının önemli bir bileşenidir. Gibson Assembly gibi teknik gelişmelerle vektör yapımı nispeten basit ve verimli hale geliyor. Bununla birlikte, Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüsünün (PRRSV) tam uzunluktaki genomu, cDNA'dan tek bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kolayca amplifiye edilemediğinde veya çoklu eklerin homolog rekombinasyonu ile tam uzunlukta bir gen ekspresyon vektörü elde etmek zor olduğunda in vitro, mevcut Gibson Assembly tekniği bu hedefe ulaşmakta başarısız olur.

Sonuç olarak, PRRSV genomunu birkaç fragmana bölmeyi ve PCR ile amplifiye edilmiş fragmanları elde etmek için ters primere uygun kısıtlama bölgelerini sokmayı amaçladık. Önceki DNA fragmanını homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektöre kattıktan sonra, yeni vektör kısıtlama enzimi bölünme bölgesini elde etti. Böylece, yeni eklenen enzim bölünme bölgesini kullanarak vektörü doğrusallaştırabilir ve bir sonraki DNA parçasını, yukarı akış DNA parçasının akış aşağısına sokabiliriz.

Yukarı akış DNA fragmanının 3' ucuna eklenen kısıtlama enzimi bölünme bölgesi elimine edilecek ve aşağı akış DNA fragmanının 3' ucuna yeni bir bölünme bölgesi eklenecektir. Bu şekilde DNA parçalarını tek tek vektöre birleştirebiliriz. Bu yöntem, PRRSV ifade vektörünü başarılı bir şekilde oluşturmak için uygulanabilir ve çok sayıda parçayı ifade vektörüne monte etmek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde ekspresyon için DNA tabanlı deneysel araçlar oluşturmak için temel bir teknik olan moleküler klonlama, deneysel biyolojinin çok önemli bir bileşenidir. Moleküler klonlama dört işlemi içerir: insert DNA'nın elde edilmesi, insertin uygun vektöre bağlanması, rekombinant vektörün Escherichia coli'ye (E. coli) dönüştürülmesi ve pozitif klonların tanımlanması¹. Şimdiye kadar, restriksiyon enzimleri ^2,3 ve PCR aracılı rekombinasyon ^4,5,6 kullanılarak DNA moleküllerini birleştirmek için birden

Protokol

1. PRRSV geninin şablonunun hazırlanması

1. Virüs stoğunu 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde çözün (bkz. Malzeme Tablosu).
2. 0.2 mL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. 3 dakika inkübe edin.
3. Karışımı 4 ° C'de 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Karışım, renksiz bir sulu faz, bir interfaz ve bir kırmızı fenol-kloroform faz olmak üzere üç faza ayrılır.
4. Renksiz sulu fazı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın.
5. Sulu fazı 0,5 mL izopropanol ile iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
6. 4 ° C'de 12.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Tü....

Tartışmalar

Gibson montaj tekniği, DNA fragmanlarının^{birleştirilmesi} için in vitro rekombinasyon tabanlı bir moleküler klonlama yöntemidir 8. Bu yöntem, birden fazla DNA fragmanının, tek tüplü bir izotermal reaksiyonda dairesel bir plazmide birleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gibson Assembly tekniğinin önündeki engellerden biri, cDNA'dan uzun parçaların elde edilmesidir. Uzun parçaların birçok nedenden dolayı doğru bir şekilde büyütülmesi zordur. Örneğin, primer.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent