Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, eklerin 3' ucunda uygun kısıtlama bölgelerini tanıtarak pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektörü doğrusallaştırabilir ve DNA parçalarını vektöre tek tek birleştirebiliriz.

Özet

Gen ekspresyon vektörlerinin inşası, deneysel biyolojide laboratuvar çalışmalarının önemli bir bileşenidir. Gibson Assembly gibi teknik gelişmelerle vektör yapımı nispeten basit ve verimli hale geliyor. Bununla birlikte, Domuz Üreme ve Solunum Sendromu Virüsünün (PRRSV) tam uzunluktaki genomu, cDNA'dan tek bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile kolayca amplifiye edilemediğinde veya çoklu eklerin homolog rekombinasyonu ile tam uzunlukta bir gen ekspresyon vektörü elde etmek zor olduğunda in vitro, mevcut Gibson Assembly tekniği bu hedefe ulaşmakta başarısız olur.

Sonuç olarak, PRRSV genomunu birkaç fragmana bölmeyi ve PCR ile amplifiye edilmiş fragmanları elde etmek için ters primere uygun kısıtlama bölgelerini sokmayı amaçladık. Önceki DNA fragmanını homolog rekombinasyon teknolojisi ile vektöre kattıktan sonra, yeni vektör kısıtlama enzimi bölünme bölgesini elde etti. Böylece, yeni eklenen enzim bölünme bölgesini kullanarak vektörü doğrusallaştırabilir ve bir sonraki DNA parçasını, yukarı akış DNA parçasının akış aşağısına sokabiliriz.

Yukarı akış DNA fragmanının 3' ucuna eklenen kısıtlama enzimi bölünme bölgesi elimine edilecek ve aşağı akış DNA fragmanının 3' ucuna yeni bir bölünme bölgesi eklenecektir. Bu şekilde DNA parçalarını tek tek vektöre birleştirebiliriz. Bu yöntem, PRRSV ifade vektörünü başarılı bir şekilde oluşturmak için uygulanabilir ve çok sayıda parçayı ifade vektörüne monte etmek için etkili bir yöntemdir.

Giriş

Prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde ekspresyon için DNA tabanlı deneysel araçlar oluşturmak için temel bir teknik olan moleküler klonlama, deneysel biyolojinin çok önemli bir bileşenidir. Moleküler klonlama dört işlemi içerir: insert DNA'nın elde edilmesi, insertin uygun vektöre bağlanması, rekombinant vektörün Escherichia coli'ye (E. coli) dönüştürülmesi ve pozitif klonların tanımlanması1. Şimdiye kadar, restriksiyon enzimleri 2,3 ve PCR aracılı rekombinasyon 4,5,6 kullanılarak DNA moleküllerini birleştirmek için birden fazla yöntem benimsenmiştir. Dikişsiz klonlama teknolojisi olarak bilinen homolog rekombinasyon, bir veya daha fazla DNA parçasının bir vektöre diziden bağımsız ve yara izi bırakmadan yerleştirilmesine izin veren klonlama yöntemleri grubudur. Bu teknoloji, dizi ve ligasyondan bağımsız klonlama (SLIC), Dikişsiz Ligasyon Klonlama Özü (SLiCE), In-Fusion ve Gibson Assembly'yi içerir. Kesici ucun bir zincirini bozmak için bir eksonükleaz ve yapışkan uçlar oluşturmak için bir vektör kullanır ve fosfodiester bağları oluşturarak eki vektöre kovalent olarak birleştirmek için in vivo onarım veya in vitro rekombinasyon kullanır. Herhangi bir dizide herhangi bir sekansta tek bir eki herhangi bir yara izi olmadan bir vektöre birleştirme yeteneği çok çekici. Ayrıca teknoloji, dizi kısıtlaması olmaksızın önceden belirlenmiş bir sırayla 5-10 parçayı birleştirme yeteneğine sahiptir.

Birçok rekombinant DNA tekniğinden biri olarak, şu anda en etkili klonlama yöntemi olan Gibson Assembly tekniği 7,8, bir veya birden fazla doğrusallaştırılmış DNA parçasını sorunsuz bir şekilde birleştirmek için sağlam ve zarif bir eksonükleaz bazlı yöntemdir. Gibson Assembly reaksiyonu, izotermal koşullar altında, 5' eksonükleaz, yüksek kaliteli polimeraz ve termostabil bir DNA ligaz olmak üzere üç enzimin bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. 5'-3' eksonükleaz tarafından oluşturulan tek iplikli 3' çıkıntılar, bir uçta tamamlayıcılığı paylaşan parçaların tavlanmasına katkıda bulunur. Yüksek kaliteli polimeraz, dNTP'ler ekleyerek tavlanmış tek sarmallı bölgelerdeki boşlukları etkili bir şekilde doldurur ve termostabil DNA ligaz, eklem DNA molekülleri oluşturmak için çentikleri kapatır8. Bu nedenle, bu teknik yöntem, gen ekspresyon vektörlerinin inşası için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Domuz üreme ve solunum sendromu (PRRS), herhangi bir9 yaşında PRRSV'nin neden olduğu domuzlarda üreme bozukluğuna ve solunum yetmezliğine yol açan viral bir hastalıktır. Sendrom ateş, iştahsızlık, zatürree, uyuşukluk, depresyon ve solunum sıkıntısı ile kendini gösterir. Ayrıca, bazı salgınlarda kulaklarda kırmızı / mavi renk değişikliği de dahil olmak üzere klinik belirtiler gözlenmiştir. Arteriyor ailesinin bir üyesi olan PRRSV, idrar, kolostrum ve tükürük dahil olmak üzere sıvıların doğrudan teması ve değişimi yoluyla domuz eti üreten ülkelere yaygın olarak bulaşır. Amerika Birleşik Devletleri'nde PRRSV'nin yayılması nedeniyle, domuz endüstrisinin toplam ekonomik kayıplarının, 664 milyon domuz ve 5.8 milyon domuzun üreme ölçeğine dayalı olarak yılda yaklaşık 110 milyon dolar olduğu tahmin edilmektedir10,11. Hayvan ve Bitki Sağlığı Denetim Servisi raporu, aşılanmamış domuzların %49,8'inin serumdaPRRSV varlığını gösterdiğini 12 ve enfekte domuzlarda düşük PRRSV seviyelerinin tükürük, burun salgıları, idrar ve dışkı yoluyla atıldığınıgöstermektedir 13. PRRSV yayılımını kontrol etmek için çoklu stratejiler uygulanmıştır 14,15,16. Tamamen virüs negatif popülasyonlar oluşturmak veya biyogüvenlik ve yönetimi iyileştirmek için eliminasyon prosedürlerine ek olarak, aşıların uygulanması PRRS'yi kontrol etmenin etkili bir yoludur.

PRRSV, yaklaşık 15 kilobaz (kb) uzunluğunda, zarflı, tek sarmallı, pozitif anlamlı bir RNA virüsüdür. PRRSV genomu, en az 10 açık okuma çerçevesi (ORF), kısa bir 5' çevrilmemiş bölge (5' UTR) ve 3' terminalinde bir poli(A) kuyruktan oluşur (Şekil 1A)17. Negatif sarmallı bir RNA virüsünün genomu bulaşıcı değildir, oysa pozitif sarmallı RNA virüslerinin genomu bulaşıcıdır. Virüs döllerini oluşturmak için RNA ve DNA transfeksiyonu için iki ana strateji vardır18. Bununla birlikte, RNA genomuna karşılık gelen tam uzunluktaki parçanın klonlanması, bulaşıcı klonların inşası için çok önemlidir. PRRSV genomunun uzun ve karmaşık doğası nedeniyle, tam uzunlukta genom bir kerede PCR yoluyla kolayca elde edilemez. Ek olarak, PRRSV genlerinin yapay sentezi etkili bir çözüm olmasına rağmen, uzun parçaların sentezi genellikle pahalıdır. Bu nedenle, PRRSV tam uzunlukta ifade vektörünü elde etmek için, onu çoklu ekler homolog rekombinasyon yöntemi19,20 ile oluşturmaya çalıştık. Ne yazık ki, tam uzunlukta gen ekspresyon vektörünü elde edemedik. Bu nedenle, bu çalışmada, ters primere uygun kısıtlama bölgeleri ekledik ve birkaç tur homolog rekombinasyon reaksiyonu ile pVAX1-PRRSV ekspresyon vektörünü başarıyla elde ettik. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda hedef genlerin silinmesini veya mutasyona uğratılmasını sağlayabilir ve çok sayıda DNA parçasını ekspresyon vektörüne verimli bir şekilde birleştirebilir.

Protokol

1. PRRSV geninin şablonunun hazırlanması

  1. Virüs stoğunu 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi içinde çözün (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. 0.2 mL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın. 3 dakika inkübe edin.
  3. Karışımı 4 ° C'de 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Karışım, renksiz bir sulu faz, bir interfaz ve bir kırmızı fenol-kloroform faz olmak üzere üç faza ayrılır.
  4. Renksiz sulu fazı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın.
  5. Sulu fazı 0,5 mL izopropanol ile iyice karıştırın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  6. 4 ° C'de 12.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Tüpün alt kısmında beyaz bir RNA çökeltisi vardır.
  7. Tüpün süpernatantını atmak için bir mikropipet kullanın.
  8. Peleti yeniden süspanse etmek ve kısaca girdap yapmak için 1 mL %75 etanol ekleyin.
  9. 4 ° C'de 7.500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün süpernatantını atmak için bir mikropipet kullanın.
  10. RNA'yı 5 dakika kurutun, RNA'yı yeniden süspanse etmek için 20-50 μL RNaz içermeyen su ekleyin ve iyice karıştırın.
  11. Ters transkripsiyon yapmaya devam edin; Tablo 1'de gösterildiği gibi ters transkripsiyon gerçekleştirmek için reaksiyonları ayarlayın.
    NOT: Başarılı bir ters transkripsiyon sağlamak için yüksek kaliteli RNA şablonları kullanın.
  12. Elde edilen cDNA'yı PCR için kullanın veya -20 °C'de saklayın.

2. PCR astar tasarımı

  1. İleri astarın tasarlanması
    1. Yazılımı açın ve Yeni DNA Dosyası'nı seçin.
    2. PRRSV gen dizisini (GenBank: FJ548852.1) NCBI'den yazılıma yapıştırın. Sıra dosyalarını oluşturmak için Tamam'a tıklayın.
    3. Diziyi analiz edin ve parça bağlantılarını işaretleyin. Parçaların ileri spesifik dizi astarını tasarlayın. Çoğu durumda, tercih edilen erime sıcaklığı (Tm) 55 °C ile 62 °C arasındadır ve GC içeriği %40-60'tır.
    4. Primer'lara tıklayın ve Primer Ekle'yi seçin.
    5. Spesifik diziyi yapıştırın ve vektörün örtüşme dizilerini, belirli dizi astarının ilk 5' nükleotidine ekleyin. Her kavşağın yakınında, iki bitişik parça arasındaki örtüşme bölgesi olarak hizmet etmek için 20-40 bp seçin.
    6. Çıkıntıları ve belirli sırayı içeren ön astarı adlandırın (bkz. Ek Şekil S1).
    7. Şablona astar ekle'ye tıklayın.
  2. Ters astarın tasarlanması
    1. Sırayı analiz edin ve yazılımdaki parça bağlantılarını işaretleyin. Parçaların ters spesifik dizi astarını tasarlayın.
    2. Primer'lara tıklayın ve Primer Ekle'yi seçin.
    3. Spesifik diziyi yapıştırın ve kısıtlama bölgesini belirli dizi astarının ilk 5' nükleotidine ekleyin.
      NOT: Eklenen kısıtlama bölgeleri, çoklu klonlama siteleri dışında, ekleme parçasında ve vektörde bulunmamalıdır.
    4. Kısıtlama bölgesinin ilk 5' nükleotidine 20-40 bp çıkıntı vektör dizileri ekleyin.
    5. Çıkıntıları ve spesifik sırayı içeren ters astarı adlandırın (bkz. Ek Şekil S1).
    6. Şablona astar ekle'ye tıklayın.

3. Parçaları yükseltmek için PCR

  1. Altı ayrı PCR reaksiyonu ayarlayın (Tablo 2): fragman 1 için P1 ve P2 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 2 için, P3 ve P4 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 3 için, P5 ve P6 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 4 için, P7 ve P8 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 5 için P9 ve P10 primerlerini kullanın; ve fragman 6'yı büyütmek için P11 ve P12 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2).
    NOT: Kullanmadan önce her bir bileşeni çözdürün, karıştırın ve kısaca santrifüjleyin.
  2. Tablo 2'deki üç adımlı protokolü kullanarak PCR'yi çalıştırın.
  3. 5 μL PCR ürününe 1 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.
  4. Numuneleri %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin.

4. PCR fragmanlarının saflaştırılması

NOT: PCR ürünlerinin bir jel ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak bir jelden saflaştırılması, vektör yapımı için önemlidir.

  1. 45 μL PCR ürününe 9 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.
  2. DNA parçalarını ayırmak için %1 agaroz jel/goldview elektroforezi gerçekleştirin.
    NOT: pH değeri DNA fragmanı geri kazanımını etkileyeceğinden TAE çalışan tamponu tekrar kullanmayın.
  3. Bantların yeterince ayrılmasından sonra, DNA bantlarını dikkatlice çıkarmak için keskin bir neşter kullanın.
    NOT: Fazla agarozu keserek jel diliminin boyutunu en aza indirin.
  4. Jel dilimini temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde tartın, jel dilimine eşit hacimde bir bağlayıcı tampon ekleyin (ör., 0.3 mL ila 0.3 g'lık bir dilim) ve 60 ° C'de 7 dakika inkübe edin.
  5. 2 mL'lik bir toplama tüpüne mini bir sütun yerleştirin. Adım 4.4'ten mini kolona 700 μL DNA/agaroz çözeltisi ekleyin.
  6. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.
  7. 300 μL bağlayıcı tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.
  8. 700 μL yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 × g'da santrifüjleyin. Süzüntüyü atın ve toplama tüpünü tekrar kullanın.
  9. Sütun matrisini kurutmak için boş mini sütunu maksimum hızda 2 dakika döndürün. Mini sütunu temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
  10. 20 μL deiyonize suyu doğrudan kolon zarının ortasına ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika bekletin. 13.000 × g hızında 1 dakika santrifüjleyin.
  11. DNA'yı -20 °C'de saklayın.

5. Doğrusallaştırılmış bir vektörün hazırlanması

NOT: Plazmidi hazırladıktan sonra, seçilen enzimler onu kesmek için kullanılabilir. Uzun sindirim veya çift enzimli sindirim, tüm DNA'nın sindirimini sağlamak için çok önemlidir. Bu, sonraki deneylerde yanlış pozitif klonların sayısını azaltacaktır.

  1. pVAX1 doğrusallaştırma
    1. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında belirtilen sırayla hazırlayın (Tablo 3).
      NOT: Belirtilen toplam reaksiyon hacmini korumak için su hacmi eklenmelidir. Burada, 1 μg plazmit, reaksiyon karışımındaki enzimlerle sindirildi. Plazmit konsantrasyonuna bağlı olarak, reaksiyon karışımında plazmitin hacmi ayarlanabilir.
    2. Yavaşça karıştırın; Sonra aşağı döndürün. 37 °C'de bir ısı bloğunda veya su termostatında 60 dakika inkübe edin.
    3. Jel ekstraksiyon kitini kullanarak bölüm 4'teki PCR fragmanlarının saflaştırılmasına benzer jel saflaştırması gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. pVAX1-F1 doğrusallaştırma
    NOT: pVAX1-F1, pVAX1'in ilk turundan (NdeI ve HindIII) ve fragman 1 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F2, pVAX1-F1 (NdeI) turundan ve fragman 2 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F3, pVAX1-F2 (NdeI) turundan ve parça 3 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F4, pVAX1-F3 (NdeI) turundan ve fragman 4 rekombinasyonundan elde edilen vektördür. pVAX1-F5, pVAX1-F4 (EcoRV ve NtoI) turundan ve fragman 5 rekombinasyonundan elde edilen vektördür.
    1. Her vektör için, reaksiyon karışımını oda sıcaklığında belirtilen sırayla ayrı ayrı hazırlayın (Tablo 3).
    2. Yavaşça karıştırın; Sonra aşağı döndürün. 37 °C'de bir ısı bloğunda veya su termostatında 60 dakika inkübe edin.
    3. Jel ekstraksiyon kitini kullanarak bölüm 4'teki PCR fragmanlarının saflaştırılmasına benzer jel saflaştırması gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).

6. Yeni bir vektöre alt klonlama

NOT: 50-200 ng vektör ve ekler kullanıldığında iyi klonlama verimliliği elde edilebilir.

  1. ExonArt dikişsiz klonlama ve montaj reaksiyonunu ayarlayın (Tablo 4). Sterilize deiyonize H2O kullanarak toplam reaksiyon hacmini 10 μL'ye ayarlayın ve karıştırın.
  2. Reaksiyonu bir termodöngüleyicide 50 ° C'de 15-60 dakika inkübe edin. Numuneleri buz üzerinde saklayın.
    NOT: Kuluçkanın 60 dakikaya kadar uzatılması montaj verimliliğini artırabilir.
  3. DH5α kimyasal olarak yetkin hücreleri buz üzerinde çözdürün.
  4. Yetkili hücrelere 10 μL montaj ürünü ekleyin; Ardından, yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.
  5. Karışımı 30 dakika buzun üzerine koyun.
  6. 45 ° C'de 45 saniye boyunca şok uygulayın ve tüpleri 3 dakika boyunca buzun üzerine aktarın.
  7. Tüpe 900 μL SOC ortamı ekleyin.
  8. Tüpü 37 ° C çalkalama makinesinde, 1 saat boyunca 225 rpm'de çalkalayın.
  9. Dönüşüm reaksiyonunu 6.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 100 μL taze SOC ortamında yeniden süspanse edin.
  10. Dönüştürülmüş hücre süspansiyonunu 50 μg/mL kanamisin içeren ayrı bir LB plakasına yayın.
  11. Tüm plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Her deney plakasından ayrı ayrı izole koloniler seçin.

7. Dönüştürücülerin analiz edilmesi

  1. 50 μg / mL kanamisin içeren 20 μL LB ortamına sekiz koloni seçin.
  2. Koloni PCR reaksiyonunu ayarlayın ve PCR'yi çalıştırın (Tablo 5).
    NOT: Fragman 1 için koloni PCR reaksiyonu için, P1 ve P2 primerlerini kullanın (bkz. Ek Dosya 1); fragman 2 için, P3 ve P4 primerlerini kullanın (Ek Dosya 1'e bakınız); fragman 3 için, P5 ve P6 primerlerini kullanın (Ek Dosya 1'e bakınız); fragman 4 için, P7 ve P8 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2); fragman 5 için P9 ve P10 primerlerini kullanın; ve fragman 6'yı tespit etmek için P11 ve P12 primerlerini kullanın (bkz. Ek Şekil S2).
  3. 5 μL PCR ürününe 1 μL 6x DNA yükleme tamponu ekleyin, karıştırın ve içeriği kısaca santrifüjleyin.
  4. Sonuçları %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin.
  5. 50 μg/mL kanamisin içeren 5 mL LB ortamına bir pozitif koloni seçin ve gece boyunca 37 °C'de büyütün.
  6. Üreticinin talimatlarına göre bir plazmid DNA mini kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak plazmidi elde edin.
  7. %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak sonuçları görselleştirin.

Sonuçlar

Bu yazıda, sürekli olarak eklenen kısıtlama bölgeleri aracılığıyla ters primer kullanarak örtüşen DNA moleküllerini birleştirmek ve onarmak için bir in vitro rekombinasyon sistemi sunuyoruz (Şekil 1B). Bu sistem, doğrusal vektörün ve PCR tarafından getirilen çıkıntıları içeren kesici uç parçalarının, uygun 5' uzatma dizilerine ve kısıtlama bölgelerine sahip primerlerle hazırlanmasını içeren basit ve verimli bir prosedürdür; bir in vitro

Tartışmalar

Gibson montaj tekniği, DNA fragmanlarınınbirleştirilmesi için in vitro rekombinasyon tabanlı bir moleküler klonlama yöntemidir 8. Bu yöntem, birden fazla DNA fragmanının, tek tüplü bir izotermal reaksiyonda dairesel bir plazmide birleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gibson Assembly tekniğinin önündeki engellerden biri, cDNA'dan uzun parçaların elde edilmesidir. Uzun parçaların birçok nedenden dolayı doğru bir şekilde büyütülmesi zordur. Örneğin, primer...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Batı Normal Üniversitesi (No. 20E059) tarafından sağlanan doktora araştırma başlatma fonlarının mali desteği ile desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

Referanslar

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55 (2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500 (2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45 (2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720 (2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410 (2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler KlonlamaPRRSVEkspresyon Vekt rGibson AssemblyPCRRestriksiyon B lgeleriHomolog RekombinasyonDNA Fragman Montaj

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır