Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В данной работе мы представляем протокол для получения вектора экспрессии pVAX1-PRRSV путем введения подходящих сайтов рестрикции на 3'-конце вставок. Мы можем линеаризовать вектор и присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим с помощью технологии гомологичной рекомбинации.
Построение векторов экспрессии генов является важной составляющей лабораторной работы в области экспериментальной биологии. Благодаря таким техническим достижениям, как сборка Gibson, векторное построение становится относительно простым и эффективным. Однако, когда полноразмерный геном вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) не может быть легко амплифицирован с помощью одной полимеразной цепной реакции (ПЦР) из кДНК или трудно получить полноразмерный вектор экспрессии генов путем гомологичной рекомбинации нескольких вставок in vitro, текущий метод сборки Gibson не достигает этой цели.
Следовательно, мы поставили перед собой цель разделить геном РРСС на несколько фрагментов и ввести соответствующие сайты рестрикции в обратный праймер для получения фрагментов, амплифицированных методом ПЦР. После присоединения предыдущего фрагмента ДНК к вектору с помощью технологии гомологичной рекомбинации новый вектор приобретал сайт расщепления фермента рестрикции. Таким образом, мы можем линеаризовать вектор, используя вновь добавленный сайт расщепления фермента, и ввести следующий фрагмент ДНК ниже по течению от вышестоящего фрагмента ДНК.
Введенный сайт расщепления фермента рестрикции на 3'-конце предшествующего фрагмента ДНК будет уничтожен, и новый сайт расщепления будет введен в 3'-конец нижестоящего фрагмента ДНК. Таким образом, мы можем присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим. Этот метод применим для успешного построения вектора экспрессии РРСС и является эффективным методом для сборки большого количества фрагментов в вектор экспрессии.
Молекулярное клонирование, являющееся важным методом создания основанных на ДНК экспериментальных инструментов для экспрессии экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках, является очень важным компонентом экспериментальной биологии. Молекулярное клонирование включает в себя четыре процесса: получение ДНК вкладыша, лигирование вкладыша в соответствующий вектор, превращение рекомбинантного вектора в Escherichia coli (E. coli) и идентификацию положительныхклонов. До сих пор было использовано несколько методов соединения молекул ДНК с использованием ферментоврестрикции 2,3
1. Подготовка матрицы гена РРСС
В данной работе мы представляем систему рекомбинации in vitro для сборки и восстановления перекрывающихся молекул ДНК с использованием обратного праймера с помощью постоянно вводимых сайтов рестрикции (рис. 1B). Эта система представляет собой простую и эффективную пр?.......
Метод сборки Гибсона представляет собой метод молекулярного клонирования на основе рекомбинации in vitro для сборки фрагментов ДНК8. Этот метод позволяет собрать несколько фрагментов ДНК в кольцевую плазмиду в ходе изотермической реакции в одной пробирке. Однако одним ?.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана финансовой поддержкой фондов для инициирования докторских исследований, предоставленных Китайским западным педагогическим университетом (No 20E059).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены