Бесшовный подход к клонированию векторов экспрессии вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней

Резюме

В данной работе мы представляем протокол для получения вектора экспрессии pVAX1-PRRSV путем введения подходящих сайтов рестрикции на 3'-конце вставок. Мы можем линеаризовать вектор и присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим с помощью технологии гомологичной рекомбинации.

Аннотация

Построение векторов экспрессии генов является важной составляющей лабораторной работы в области экспериментальной биологии. Благодаря таким техническим достижениям, как сборка Gibson, векторное построение становится относительно простым и эффективным. Однако, когда полноразмерный геном вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) не может быть легко амплифицирован с помощью одной полимеразной цепной реакции (ПЦР) из кДНК или трудно получить полноразмерный вектор экспрессии генов путем гомологичной рекомбинации нескольких вставок in vitro, текущий метод сборки Gibson не достигает этой цели.

Следовательно, мы поставили перед собой цель разделить геном РРСС на несколько фрагментов и ввести соответствующие сайты рестрикции в обратный праймер для получения фрагментов, амплифицированных методом ПЦР. После присоединения предыдущего фрагмента ДНК к вектору с помощью технологии гомологичной рекомбинации новый вектор приобретал сайт расщепления фермента рестрикции. Таким образом, мы можем линеаризовать вектор, используя вновь добавленный сайт расщепления фермента, и ввести следующий фрагмент ДНК ниже по течению от вышестоящего фрагмента ДНК.

Введенный сайт расщепления фермента рестрикции на 3'-конце предшествующего фрагмента ДНК будет уничтожен, и новый сайт расщепления будет введен в 3'-конец нижестоящего фрагмента ДНК. Таким образом, мы можем присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим. Этот метод применим для успешного построения вектора экспрессии РРСС и является эффективным методом для сборки большого количества фрагментов в вектор экспрессии.

Введение

Молекулярное клонирование, являющееся важным методом создания основанных на ДНК экспериментальных инструментов для экспрессии экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках, является очень важным компонентом экспериментальной биологии. Молекулярное клонирование включает в себя четыре процесса: получение ДНК вкладыша, лигирование вкладыша в соответствующий вектор, превращение рекомбинантного вектора в Escherichia coli (E. coli) и идентификацию положительных^{клонов.} До сих пор было использовано несколько методов соединения молекул ДНК с использованием ферментов^{рестрикции 2,3}

протокол

1. Подготовка матрицы гена РРСС

1. Разморозьте запас вируса в 1 мл реагента для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
2. Добавьте 0,2 мл хлороформа и тщательно перемешайте. Выдерживать 3 мин.
3. Центрифугируйте смесь в течение 15 мин при 12 000 × г при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь делится на три фазы, а именно: бесцветную водную фазу, интерфазу и красную фенол-хлороформную фазу.
4. Пипетируйте бесцветную водную воду в фазе и переложите ее в новую пробирку.
5. Тщательно перемешайте водную фазу с 0,5 мл изопропанола и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
6. Центрифугировать в течен....

Результаты

В данной работе мы представляем систему рекомбинации in vitro для сборки и восстановления перекрывающихся молекул ДНК с использованием обратного праймера с помощью постоянно вводимых сайтов рестрикции (рис. 1B). Эта система представляет собой простую и эффективную пр?.......

Обсуждение

Метод сборки Гибсона представляет собой метод молекулярного клонирования на основе рекомбинации in vitro для сборки фрагментов ДНК⁸. Этот метод позволяет собрать несколько фрагментов ДНК в кольцевую плазмиду в ходе изотермической реакции в одной пробирке. Однако одним ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent