Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы представляем протокол для получения вектора экспрессии pVAX1-PRRSV путем введения подходящих сайтов рестрикции на 3'-конце вставок. Мы можем линеаризовать вектор и присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим с помощью технологии гомологичной рекомбинации.

Аннотация

Построение векторов экспрессии генов является важной составляющей лабораторной работы в области экспериментальной биологии. Благодаря таким техническим достижениям, как сборка Gibson, векторное построение становится относительно простым и эффективным. Однако, когда полноразмерный геном вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС) не может быть легко амплифицирован с помощью одной полимеразной цепной реакции (ПЦР) из кДНК или трудно получить полноразмерный вектор экспрессии генов путем гомологичной рекомбинации нескольких вставок in vitro, текущий метод сборки Gibson не достигает этой цели.

Следовательно, мы поставили перед собой цель разделить геном РРСС на несколько фрагментов и ввести соответствующие сайты рестрикции в обратный праймер для получения фрагментов, амплифицированных методом ПЦР. После присоединения предыдущего фрагмента ДНК к вектору с помощью технологии гомологичной рекомбинации новый вектор приобретал сайт расщепления фермента рестрикции. Таким образом, мы можем линеаризовать вектор, используя вновь добавленный сайт расщепления фермента, и ввести следующий фрагмент ДНК ниже по течению от вышестоящего фрагмента ДНК.

Введенный сайт расщепления фермента рестрикции на 3'-конце предшествующего фрагмента ДНК будет уничтожен, и новый сайт расщепления будет введен в 3'-конец нижестоящего фрагмента ДНК. Таким образом, мы можем присоединять фрагменты ДНК к вектору один за другим. Этот метод применим для успешного построения вектора экспрессии РРСС и является эффективным методом для сборки большого количества фрагментов в вектор экспрессии.

Введение

Молекулярное клонирование, являющееся важным методом создания основанных на ДНК экспериментальных инструментов для экспрессии экспрессии в прокариотических и эукариотических клетках, является очень важным компонентом экспериментальной биологии. Молекулярное клонирование включает в себя четыре процесса: получение ДНК вкладыша, лигирование вкладыша в соответствующий вектор, превращение рекомбинантного вектора в Escherichia coli (E. coli) и идентификацию положительныхклонов. До сих пор было использовано несколько методов соединения молекул ДНК с использованием ферментоврестрикции 2,3

протокол

1. Подготовка матрицы гена РРСС

  1. Разморозьте запас вируса в 1 мл реагента для экстракции РНК (см. Таблицу материалов).
  2. Добавьте 0,2 мл хлороформа и тщательно перемешайте. Выдерживать 3 мин.
  3. Центрифугируйте смесь в течение 15 мин при 12 000 × г при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь делится на три фазы, а именно: бесцветную водную фазу, интерфазу и красную фенол-хлороформную фазу.
  4. Пипетируйте бесцветную водную воду в фазе и переложите ее в новую пробирку.
  5. Тщательно перемешайте водную фазу с 0,5 мл изопропанола и инкубируйте в течение 10 минут при 4 °C.
  6. Центрифугировать в течен....

Результаты

В данной работе мы представляем систему рекомбинации in vitro для сборки и восстановления перекрывающихся молекул ДНК с использованием обратного праймера с помощью постоянно вводимых сайтов рестрикции (рис. 1B). Эта система представляет собой простую и эффективную пр?.......

Обсуждение

Метод сборки Гибсона представляет собой метод молекулярного клонирования на основе рекомбинации in vitro для сборки фрагментов ДНК8. Этот метод позволяет собрать несколько фрагментов ДНК в кольцевую плазмиду в ходе изотермической реакции в одной пробирке. Однако одним ?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансовой поддержкой фондов для инициирования докторских исследований, предоставленных Китайским западным педагогическим университетом (No 20E059).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

Ссылки

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, ....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены