Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3' des inserts. Nous pouvons linéariser le vecteur et joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue.

Résumé

La construction de vecteurs d’expression génique est une composante importante des travaux de laboratoire en biologie expérimentale. Avec les progrès techniques tels que l’assemblage Gibson, la construction vectorielle devient relativement simple et efficace. Cependant, lorsque le génome complet du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) ne peut pas être facilement amplifié par une seule réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de l’ADNc, ou qu’il est difficile d’acquérir un vecteur d’expression génique complet par recombinaison homologue de plusieurs inserts in vitro, la technique actuelle d’assemblage de Gibson ne parvient pas à atteindre cet objectif.

Par conséquent, nous avons cherché à diviser le génome du SDRP en plusieurs fragments et à introduire des sites de restriction appropriés dans l’amorce inverse pour obtenir des fragments amplifiés par PCR. Après avoir joint le fragment d’ADN précédent dans le vecteur par la technologie de recombinaison homologue, le nouveau vecteur a acquis le site de clivage de l’enzyme de restriction. Ainsi, nous pouvons linéariser le vecteur en utilisant le site de clivage enzymatique nouvellement ajouté et introduire le fragment d’ADN suivant en aval du fragment d’ADN en amont.

Le site de clivage de l’enzyme de restriction introduit à l’extrémité 3' du fragment d’ADN en amont sera éliminé, et un nouveau site de clivage sera introduit à l’extrémité 3' du fragment d’ADN en aval. De cette façon, nous pouvons joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un. Cette méthode est applicable pour construire avec succès le vecteur d’expression du SDRP et constitue une méthode efficace pour assembler un grand nombre de fragments dans le vecteur d’expression.

Introduction

En tant que technique essentielle pour construire des outils expérimentaux basés sur l’ADN pour l’expression dans les cellules procaryotes et eucaryotes, le clonage moléculaire est une composante très importante de la biologie expérimentale. Le clonage moléculaire implique quatre processus : l’acquisition de l’ADN de l’insert, la ligature de l’insert dans le vecteur approprié, la transformation du vecteur recombinant en Escherichia coli (E. coli) et l’identification des clones positifs¹. Jusqu’à présent, plusieurs méthodes ont été adoptées pour assembler des molécules d’ADN en utilisant des enzymes de restriction

Protocole

1. Préparation du modèle du gène du SDRP

1. Décongeler le stock viral dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matières).
2. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 3 min.
3. Centrifuger le mélange pendant 15 min à 12 000 × g à 4 °C.
   REMARQUE : Le mélange est divisé en trois phases, à savoir, une phase aqueuse incolore, une interphase et une phase phénol-chloroforme rouge.
4. Pipetez la phase aqueuse incolore et transférez-la dans un nouveau tube.
5. Bien mélanger la phase aqueuse avec 0,5 mL d’isopropanol et incuber pendant 10 min à 4 °C.
....

Discussion

La technique d’assemblage Gibson est une méthode de clonage moléculaire basée sur la recombinaison in vitro pour l’assemblage de fragments d’ADN⁸. Cette méthode permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN en un plasmide circulaire dans une réaction isotherme à tube unique. Cependant, l’un des obstacles à la technique d’assemblage Gibson est l’acquisition de longs fragments à partir d’ADNc. Les longs fragments sont difficiles à amplifier avec précision pour de .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent