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  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 대표적 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기에서는 인서트의 3' 말단에 적절한 제한 부위를 도입하여 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상동 재조합 기술을 통해 벡터를 선형화하고 DNA 단편을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다.

초록

유전자 발현 벡터의 구성은 실험 생물학에서 실험실 작업의 중요한 구성 요소입니다. Gibson Assembly와 같은 기술 발전으로 벡터 구성이 상대적으로 간단하고 효율적이 되었습니다. 그러나 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 전장 게놈이 cDNA의 단일 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 쉽게 증폭될 수 없거나 시험관 내에서 여러 삽입물의 상동 재조합으로 전장 유전자 발현 벡터를 획득하기 어려운 경우 현재의 Gibson Assembly 기술로는 이 목표를 달성하지 못합니다.

결과적으로, 우리는 PRRSV 게놈을 여러 단편으로 나누고 PCR 증폭 단편을 얻기 위해 역 프라이머에 적절한 제한 부위를 도입하는 것을 목표로 했습니다. 상동 재조합 기술에 의해 이전의 DNA 단편을 벡터에 결합한 후, 새로운 벡터는 제한 효소 절단 부위를 획득했습니다. 따라서 새로 추가된 효소 절단 부위를 사용하여 벡터를 선형화하고 업스트림 DNA 단편의 다운스트림에 다음 DNA 단편을 도입할 수 있습니다.

업스트림 DNA 단편의 3' 말단에 도입된 제한효소 절단 부위가 제거되고, 새로운 절단 부위가 다운스트림 DNA 단편의 3' 말단에 도입됩니다. 이런 식으로 DNA 조각을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다. 이 방법은 PRRSV 발현 벡터를 성공적으로 구성하는 데 적용할 수 있으며, 많은 수의 단편을 발현 벡터로 조립하는 데 효과적인 방법입니다.

서문

원핵 및 진핵 세포에서 발현을 위한 DNA 기반 실험 도구를 구성하는 데 필수적인 기술로서 분자 클로닝은 실험 생물학의 매우 중요한 구성 요소입니다. 분자 클로닝은 삽입 DNA의 획득, 적절한 벡터로의 삽입물의 ligation, 재조합 벡터를 대장균(E. coli)으로의 변환, 양성 클론의 식별의 네 가지 프로세스를 포함합니다1. 지금까지 제한 효소 2,3 및 PCR 매개 재조합 4,5,6을 사용하여 DNA 분자를 결합하기 위해 여러 가지 방법이 채택되었습니다. Seamless cloning 기술로 알려진 Homologous recombination은 벡터에 하나 이상의 DNA 단편을 서열에 독립적이고 흉터 없이 삽입할 수 있는 클로닝 방법 그룹입니다. 이 기술에는 염기서열 및 결찰 독립적 클로닝(SLIC), 이음매 없는 결찰 클로닝 추출물(SLiCE), In-Fusion 및 Gibson Assembly가 포함됩니다. 엑소뉴클레아제를 사용하여 삽입체....

프로토콜

1. PRRSV 유전자 템플릿의 제조

  1. RNA 추출 시약 1mL에서 바이러스 스톡을 해동합니다( 재료 표 참조).
  2. 클로로포름 0.2mL를 넣고 잘 섞는다. 3분 동안 배양합니다.
  3. 혼합물을 4°C에서 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
    알림: 혼합물은 무색 수성상, 간기 및 적색 페놀-클로로포름 상의 세 단계로 나뉩니다.
  4. 무색 수성을 단계적으로 피펫하여 새 튜브로 옮깁니다.
  5. 수성상을 0.5mL의 이소프로판올과 철저히 혼합하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
  6. 4°C에서 12,000× g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
    참고: 튜브 바닥에는 흰색 RNA 침전물이 있습니다.
  7. 마이크로피펫을 사용하여 튜브의 상층액을 버립니다.
  8. 1mL의 75% 에탄올을 첨가하여 펠릿과 와류를 잠시 재현탁시킵니다.
  9. 4 °C에서 7,500 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로피펫을 사용하여 튜브의 상층액을 버립니다.
  10. RNA를 5분 동안 건조시키고 RNase가 없는 물 20-50μL를 추가하여 RNA....

대표적 결과

이 논문에서는 지속적으로 도입된 restriction site를 통해 reverse primer를 사용하여 겹치는 DNA 분자를 조립하고 수리하는 in vitro recombination system을 제시합니다(그림 1B). 이 체계는 선형 벡터의 준비를 포함하는 및 적합한 5' 연장 순서 및 제한 위치를 비치하는 뇌관을 가진 PCR에 의해 소개된 돌출부를 포함하는 삽입 파편의 준비를 포함하는 포함하는 간단한 능률적인 절차입?.......

토론

Gibson 조립 기술은 DNA 단편8의 조립을 위한 시험관 내 재조합 기반 분자 클로닝 방법입니다. 이 방법을 사용하면 단일 튜브 등온 반응에서 여러 DNA 단편을 원형 플라스미드로 조립할 수 있습니다. 그러나 Gibson Assembly 기술의 장애물 중 하나는 cDNA에서 긴 단편을 획득하는 것입니다. 긴 조각은 여러 가지 이유로 정확하게 증폭하기 어렵습니다. 예를 들어, 프라이머는 장시간 ?.......

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 서부 사범 대학(No. 20E059)에서 제공하는 박사 연구 시작 기금의 재정 지원으로 지원되었습니다.

....

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

참고문헌

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, ....

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PRRSVGibsonPCRDNA

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