A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
تنظم إيقاعات الساعة البيولوجية ، الموجودة في معظم الكائنات الحية ، التنظيم الزمني للعمليات البيولوجية. ظهرت المواد العضوية 3D مؤخرا كنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . يصف هذا البروتوكول استخدام مراسلي التوهج الحيوي لمراقبة إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية ، مما يتيح إجراء تحقيقات في المختبر لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا.
تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية ، وهي عمليات بيولوجية تحدث خلال فترة 24 ساعة تقريبا وتنظم ذخيرة متنوعة من العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من دورات النوم والاستيقاظ إلى التمثيل الغذائي. تعمل آلية الساعة هذه على تقييد الكائن الحي بناء على التغيرات البيئية وتنسق التنظيم الزمني للأحداث الجزيئية والفسيولوجية. في السابق ، ثبت أن إيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة يتم الحفاظ عليها حتى على مستوى الخلية الواحدة باستخدام خطوط الخلايا مثل الخلايا الليفية NIH3T3 ، والتي كانت مفيدة في الكشف عن آليات إيقاعات الساعة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه عبارة عن ثقافات متجانسة تفتقر إلى تعدد الخلايا والاتصالات القوية بين الخلايا. في العقد الماضي ، تم إجراء عمل مكثف على تطوير وتوصيف وتطبيق المواد العضوية 3D ، والتي هي في أنظمة متعددة الخلايا في المختبر تشبه الهياكل والوظائف المورفولوجية في الجسم الحي . تصف هذه الورقة بروتوكولا للكشف عن إيقاعات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل مضيئة بيولوجيا في الأمعاء المعوية البشرية ، مما يتيح التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر.
الساعة البيولوجية
جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الثدييات ، لها علاقة معقدة وديناميكية مع بيئتها. في إطار هذه العلاقة ، يعد التكيف مع التغيرات البيئية أمرا بالغ الأهمية لبقاء الكائنات الحية. تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية تمكنها من التكيف وتحسين وظائفها مع الدورات النهارية التي تبلغ حوالي 24 ساعة. الساعة البيولوجية هي شبكة هرمية من الساعات المركزية والمحيطية التي تعمل بالتعاون للحفاظ على التوازن الفسيولوجي والحفاظ على تزامن الكائنات الحية مع التغيرات اليومية 1,2. في الثدييات ، تتلقى الساعة المركزية أو الرئيسية الموجودة في النواة فوق التصالبية (SCN) إشارات خارجية ، مثل الضوء....
تمت الموافقة على جميع التجارب التي تستخدم الأنسجة البشرية لتوليد HIEs من قبل IRB في CCHMC (IRB # 2014-0427). انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.
ملاحظة: لتوضيح الإجراء الموضح في هذا البروتوكول ، استخدمنا Bmal1-luc الأمعاء المعوية البشرية (HIEs). خضعت هذه المعوية لعملية نقل عدسية مستقرة22 مع بلازميد مراسل pABpuro-BluF ، والذي يحتوي على مروج Bmal1 المنصهر مع luciferase ، مما يدل على نشاط مروج Bmal1 21.
1. نقل الفيروسات النسرية
تم إجراء تسجيل التلألؤ البيولوجي لتقييم إيقاع الساعة البيولوجية للمعوية المعوية البشرية (HIEs) في ظل حالتين متميزتين: الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية باستخدام وسط نمو عضوي معوي (الشكل 3) مقابل الظروف المحفزة للتمايز ، والتي تم تحقيقها عن طريق استبدال وسط نمو الأعضاء المعوية.......
يوفر اختبار التلألؤ الحيوي العديد من المزايا للتحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية ، الأمر الذي يتطلب جمع البيانات من تجارب الدورة الزمنية طويلة الأجل. أولا ، يمكن الباحثين من مراقبة التعبير الجيني أو البروتين محل الاهتمام أثناء تحرك الخلايا وتكاثرها. دون إجراء تعديلات غير ضرورية أو تعطي.......
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
تم الحصول على الأمعاء المعوية البشرية من مختبر الدكتور مايكل هيلمراث في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC). تم دعم هذا العمل من قبل R01 DK11005 (CIH) والتمويل التجريبي لمركز السرطان بجامعة سينسيناتي. نحن ممتنون لدعم التصوير من جامعة سينسيناتي لايف ميكروسكوب كور (NIH S10OD030402).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 x 10 Falcon tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | |
A 83-01 | Sigma Aldrich | SML0788 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-028 | |
B-27 Supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-829-1Bb | Mfrn: BD 329424 |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | GSK-3 inhibitor |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902-500MG | |
D-Luciferin (potassium salt) | Cayman Chemical | 14681 | |
Gastrin I Human | Sigma Aldrich | G9020 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel | Corning | CB-40230C | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stemcell Technologies | 06010 | Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium |
Kronos Dio Luminometer Machine | ATTO Corporation | AB-2550 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165 | |
pABpuro-BluF reporter plasmid | Addgene | 46824 | |
PBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Recombinant murine EGF | PeproTech | 315-09 | |
Y-27632 | R&D Systems | 1254/10 | ROCK inhibitor |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved