مراقبة تذبذبات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل التلألؤ البيولوجي في المواد العضوية

Summary

تنظم إيقاعات الساعة البيولوجية ، الموجودة في معظم الكائنات الحية ، التنظيم الزمني للعمليات البيولوجية. ظهرت المواد العضوية 3D مؤخرا كنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . يصف هذا البروتوكول استخدام مراسلي التوهج الحيوي لمراقبة إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية ، مما يتيح إجراء تحقيقات في المختبر لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا.

Abstract

تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية ، وهي عمليات بيولوجية تحدث خلال فترة 24 ساعة تقريبا وتنظم ذخيرة متنوعة من العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من دورات النوم والاستيقاظ إلى التمثيل الغذائي. تعمل آلية الساعة هذه على تقييد الكائن الحي بناء على التغيرات البيئية وتنسق التنظيم الزمني للأحداث الجزيئية والفسيولوجية. في السابق ، ثبت أن إيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة يتم الحفاظ عليها حتى على مستوى الخلية الواحدة باستخدام خطوط الخلايا مثل الخلايا الليفية NIH3T3 ، والتي كانت مفيدة في الكشف عن آليات إيقاعات الساعة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه عبارة عن ثقافات متجانسة تفتقر إلى تعدد الخلايا والاتصالات القوية بين الخلايا. في العقد الماضي ، تم إجراء عمل مكثف على تطوير وتوصيف وتطبيق المواد العضوية 3D ، والتي هي في أنظمة متعددة الخلايا في المختبر تشبه الهياكل والوظائف المورفولوجية في الجسم الحي . تصف هذه الورقة بروتوكولا للكشف عن إيقاعات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل مضيئة بيولوجيا في الأمعاء المعوية البشرية ، مما يتيح التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر.

Introduction

الساعة البيولوجية
جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الثدييات ، لها علاقة معقدة وديناميكية مع بيئتها. في إطار هذه العلاقة ، يعد التكيف مع التغيرات البيئية أمرا بالغ الأهمية لبقاء الكائنات الحية. تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية تمكنها من التكيف وتحسين وظائفها مع الدورات النهارية التي تبلغ حوالي 24 ساعة. الساعة البيولوجية هي شبكة هرمية من الساعات المركزية والمحيطية التي تعمل بالتعاون للحفاظ على التوازن الفسيولوجي والحفاظ على تزامن الكائنات الحية مع التغيرات اليومية ^1,2. في الثدييات ، تتلقى الساعة المركزية أو الرئيسية الموجودة في النواة فوق التصالبية (SCN) إشارات خارجية ، مثل الضوء....

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب التي تستخدم الأنسجة البشرية لتوليد HIEs من قبل IRB في CCHMC (IRB # 2014-0427). انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

ملاحظة: لتوضيح الإجراء الموضح في هذا البروتوكول ، استخدمنا Bmal1-luc الأمعاء المعوية البشرية (HIEs). خضعت هذه المعوية لعملية نقل عدسية مستقرة²² مع بلازميد مراسل pABpuro-BluF ، والذي يحتوي على مروج Bmal1 المنصهر مع luciferase ، مما يدل على نشاط مروج Bmal1 ²¹.

1. نقل الفيروسات النسرية

1. إجراء نقل الفيروس

النتائج

تم إجراء تسجيل التلألؤ البيولوجي لتقييم إيقاع الساعة البيولوجية للمعوية المعوية البشرية (HIEs) في ظل حالتين متميزتين: الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية باستخدام وسط نمو عضوي معوي (الشكل 3) مقابل الظروف المحفزة للتمايز ، والتي تم تحقيقها عن طريق استبدال وسط نمو الأعضاء المعوية.......

Discussion

يوفر اختبار التلألؤ الحيوي العديد من المزايا للتحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية ، الأمر الذي يتطلب جمع البيانات من تجارب الدورة الزمنية طويلة الأجل. أولا ، يمكن الباحثين من مراقبة التعبير الجيني أو البروتين محل الاهتمام أثناء تحرك الخلايا وتكاثرها. دون إجراء تعديلات غير ضرورية أو تعطي.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor