A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تنظم إيقاعات الساعة البيولوجية ، الموجودة في معظم الكائنات الحية ، التنظيم الزمني للعمليات البيولوجية. ظهرت المواد العضوية 3D مؤخرا كنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . يصف هذا البروتوكول استخدام مراسلي التوهج الحيوي لمراقبة إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية ، مما يتيح إجراء تحقيقات في المختبر لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا.

Abstract

تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية ، وهي عمليات بيولوجية تحدث خلال فترة 24 ساعة تقريبا وتنظم ذخيرة متنوعة من العمليات الخلوية والفسيولوجية التي تتراوح من دورات النوم والاستيقاظ إلى التمثيل الغذائي. تعمل آلية الساعة هذه على تقييد الكائن الحي بناء على التغيرات البيئية وتنسق التنظيم الزمني للأحداث الجزيئية والفسيولوجية. في السابق ، ثبت أن إيقاعات الساعة البيولوجية المستقلة يتم الحفاظ عليها حتى على مستوى الخلية الواحدة باستخدام خطوط الخلايا مثل الخلايا الليفية NIH3T3 ، والتي كانت مفيدة في الكشف عن آليات إيقاعات الساعة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا هذه عبارة عن ثقافات متجانسة تفتقر إلى تعدد الخلايا والاتصالات القوية بين الخلايا. في العقد الماضي ، تم إجراء عمل مكثف على تطوير وتوصيف وتطبيق المواد العضوية 3D ، والتي هي في أنظمة متعددة الخلايا في المختبر تشبه الهياكل والوظائف المورفولوجية في الجسم الحي . تصف هذه الورقة بروتوكولا للكشف عن إيقاعات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل مضيئة بيولوجيا في الأمعاء المعوية البشرية ، مما يتيح التحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا في المختبر.

Introduction

الساعة البيولوجية
جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الثدييات ، لها علاقة معقدة وديناميكية مع بيئتها. في إطار هذه العلاقة ، يعد التكيف مع التغيرات البيئية أمرا بالغ الأهمية لبقاء الكائنات الحية. تمتلك معظم الكائنات الحية إيقاعات يومية تمكنها من التكيف وتحسين وظائفها مع الدورات النهارية التي تبلغ حوالي 24 ساعة. الساعة البيولوجية هي شبكة هرمية من الساعات المركزية والمحيطية التي تعمل بالتعاون للحفاظ على التوازن الفسيولوجي والحفاظ على تزامن الكائنات الحية مع التغيرات اليومية 1,2. في الثدييات ، تتلقى الساعة المركزية أو الرئيسية الموجودة في النواة فوق التصالبية (SCN) إشارات خارجية ، مثل الضوء....

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب التي تستخدم الأنسجة البشرية لتوليد HIEs من قبل IRB في CCHMC (IRB # 2014-0427). انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

ملاحظة: لتوضيح الإجراء الموضح في هذا البروتوكول ، استخدمنا Bmal1-luc الأمعاء المعوية البشرية (HIEs). خضعت هذه المعوية لعملية نقل عدسية مستقرة22 مع بلازميد مراسل pABpuro-BluF ، والذي يحتوي على مروج Bmal1 المنصهر مع luciferase ، مما يدل على نشاط مروج Bmal1 21.

1. نقل الفيروسات النسرية

  1. إجراء نقل الفيروس

النتائج

تم إجراء تسجيل التلألؤ البيولوجي لتقييم إيقاع الساعة البيولوجية للمعوية المعوية البشرية (HIEs) في ظل حالتين متميزتين: الظروف المخصبة بالخلايا الجذعية باستخدام وسط نمو عضوي معوي (الشكل 3) مقابل الظروف المحفزة للتمايز ، والتي تم تحقيقها عن طريق استبدال وسط نمو الأعضاء المعوية.......

Discussion

يوفر اختبار التلألؤ الحيوي العديد من المزايا للتحقيق في إيقاعات الساعة البيولوجية ، الأمر الذي يتطلب جمع البيانات من تجارب الدورة الزمنية طويلة الأجل. أولا ، يمكن الباحثين من مراقبة التعبير الجيني أو البروتين محل الاهتمام أثناء تحرك الخلايا وتكاثرها. دون إجراء تعديلات غير ضرورية أو تعطي.......

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم الحصول على الأمعاء المعوية البشرية من مختبر الدكتور مايكل هيلمراث في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال (CCHMC). تم دعم هذا العمل من قبل R01 DK11005 (CIH) والتمويل التجريبي لمركز السرطان بجامعة سينسيناتي. نحن ممتنون لدعم التصوير من جامعة سينسيناتي لايف ميكروسكوب كور (NIH S10OD030402).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35 x 10 Falcon tissue culture dishesFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin SyringesFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inhibitor
DexamethasoneSigma AldrichD4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Growth Factor reduced (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer MachineATTO CorporationAB-2550
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmidAddgene46824
PBS without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant murine EGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK inhibitor

References

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NIH3T3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved