Monitoraggio delle oscillazioni circadiane con un reporter di bioluminescenza negli organoidi

Riepilogo

I ritmi circadiani, che esistono nella maggior parte degli organismi, regolano l'organizzazione temporale dei processi biologici. Gli organoidi 3D sono recentemente emersi come modello in vitro fisiologicamente rilevante. Questo protocollo descrive l'uso di reporter bioluminescenti per osservare i ritmi circadiani negli organoidi, consentendo indagini in vitro dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari.

Abstract

La maggior parte degli organismi viventi possiede ritmi circadiani, che sono processi biologici che si verificano entro un periodo di circa 24 ore e regolano un repertorio diversificato di processi cellulari e fisiologici che vanno dai cicli sonno-veglia al metabolismo. Questo meccanismo dell'orologio trascina l'organismo in base ai cambiamenti ambientali e coordina la regolazione temporale degli eventi molecolari e fisiologici. In precedenza, è stato dimostrato che i ritmi circadiani autonomi vengono mantenuti anche a livello di singola cellula utilizzando linee cellulari come i fibroblasti NIH3T3, che sono stati determinanti per scoprire i meccanismi dei ritmi circadiani. Tuttavia, queste linee cellulari sono colture omogenee prive di multicellularità e di robuste comunicazioni intercellulari. Nell'ultimo decennio, è stato svolto un ampio lavoro sullo sviluppo, la caratterizzazione e l'applicazione di organoidi 3D, che sono sistemi multicellulari in vitro che assomigliano a strutture e funzioni morfologiche in vivo . Questo articolo descrive un protocollo per rilevare i ritmi circadiani utilizzando un reporter bioluminescente negli enteroidi intestinali umani, che consente lo studio dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro.

Introduzione

Orologio circadiano
Tutti gli organismi, dai batteri ai mammiferi, hanno una relazione complessa e dinamica con il loro ambiente. All'interno di questa relazione, l'adattamento ai cambiamenti ambientali è fondamentale per la sopravvivenza degli organismi. La maggior parte degli organismi possiede ritmi circadiani che consentono loro di adattarsi e ottimizzare le proprie funzioni a cicli diurni di circa 24 ore. L'orologio circadiano è una rete gerarchica di orologi centrali e periferici che lavorano in cooperazione per mantenere l'omeostasi fisiologica e mantenere gli organismi sincronizzati con i cambiamenti giornalieri ^1,2. Nei mammiferi, l'orologio centrale o master situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN) riceve segnali esterni, come la luce, e trasmette le informazioni agli orologi periferici attraverso un'interazione avanzata di vie di segnalazione neurali e umorali³. Oltre all'orologio centrale, i tessuti periferici possiedono un proprio meccanismo di orologio circadiano autonomo dalle cellule, mantenuto da un ciclo di feedback negativo trascrizionale-traduzionale (TTFL) che regola i geni controllati dall'orologio tessuto-specifici (CCGs)^4,5. Questo macchinario molecolare produce una ritmicità di circa 24 ore in eventi cellulari e fisiologici, come espressioni geniche, vie di segnalazione, risposte immunitarie e digestione. L'orologio circadiano è presente in quasi tutte le cellule di mammifero ed è stato dimostrato che fino al 50% dei modelli di espressione dei geni mostra una ritmicità circadiana⁶. Considerando l'abbondanza di CCG, l'interruzione di questo meccanismo di clock può causare problemi fisiologici critici. Pertanto, le indagini sui ritmi circadiani sono necessarie per chiarire i meccanismi biologici essenziali e sviluppare nuove strategie terapeutiche.

Sistema reporter luciferasi
Negli studi circadiani, il monitoraggio in tempo reale è fondamentale per una migliore comprensione dei comportamenti e delle risposte cellulari perché consente di tracciare i cambiamenti temporali nell'espressione genica e/o nei livelli proteici, fornendo informazioni sui meccanismi molecolari regolati dall'orologio circadiano. Inoltre, il monitoraggio in tempo reale consente ai ricercatori di studiare gli effetti dei cambiamenti ambientali sui meccanismi molecolari ^7,8. Esistono numerose tecniche per gli studi di monitoraggio in tempo reale, tra cui il saggio di bioluminescenza, ampiamente utilizzato per monitorare l'espressione genica o i livelli di proteine nel tempo. Il saggio di bioluminescenza è un metodo per rilevare i processi biologici utilizzando la produzione di luce come lettura. In questo saggio, un enzima ossidativo che produce bioluminescenza (ad esempio, luciferasi) viene trasfettato transitoriamente o stabilmente nelle cellule di interesse e la lettura della bioluminescenza viene misurata in presenza di un substrato (ad esempio, luciferina) nel tempo. Ad esempio, l'enzima luciferasi produce bioluminescenza ossidando il substrato luciferina in presenza di ATP⁹. Grazie alla sua breve emivita, 3-4 ore^{e 10} ore, la luciferasi delle lucciole è uno strumento potente per gli studi circadiani in termini di monitoraggio dinamico in tempo reale con rumore di fondo minimo 11,12,13. Per l'inserimento di DNA con un promotore marcato con luciferasi o un telaio di lettura aperto (ORF), il sistema di consegna genica lentivirale è un metodo affidabile che fornisce un'elevata efficacia di trasduzione, un'integrazione stabile e una bassa immunogenicità. La trasduzione stabile di un reporter bioluminescente fornisce un'espressione robusta nelle cellule in divisione e non in divisione, generando dati coerenti per gli studi circadiani¹⁴.

Organoide come modello
Le tradizionali linee cellulari bidimensionali immortalizzate sono state determinanti in studi biologici che vanno dalla scoperta dei meccanismi molecolari fondamentali dei ritmi circadiani allo screening dei farmaci. Nonostante la convenienza dell'utilizzo di linee cellulari omogeneizzate, mancano di strutture multicellulari e interazioni intercellulari. Al contrario, gli organoidi sono strutture multicellulari "organiche" 3D in vitro che imitano la struttura degli organi in un piatto mostrando somiglianza con l'architettura dei tessuti in vivo e la multicellularità, inclusi i tipi di cellule staminali, progenitrici e differenziate^15,16. Il possesso di caratteristiche di auto-organizzazione, multicellularità e funzionalità rende gli organoidi un notevole modello in vitro che rappresenta i processi cellulari e fisiologici che avvengono nei tessuti reali¹⁷. Diversi tipi di organoidi possono essere derivati da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretta o cellule staminali adulte raccolte da vari organi, tra cui l'intestino tenue, il cervello, il fegato, il polmone e il rene^18,19. Poiché le strutture degli organoidi possiedono un'architettura e una funzione simile a quella dei tessuti con la multicellularità e l'interazione dinamica cellula-cellula, sono superiori alle linee cellulari omogeneizzate per comprendere gli eventi cellulari che si verificano nei tessuti in vivo. Gli organoidi sono anche facilmente manipolabili e possono essere coltivati in condizioni controllate, il che li rende utili per gli studi circadiani²⁰.

Lo scopo principale di questo lavoro è quello di introdurre un metodo di monitoraggio in tempo reale utilizzando un saggio di bioluminescenza specificamente studiato per lo studio dei ritmi circadiani in organoidi 3D multicellulari. Il monitoraggio in tempo reale degli eventi cellulari utilizzando una tecnica di saggio di bioluminescenza è stato ampiamente eseguito per colture cellulari prive della complessità multicellulare e delle comunicazioni intercellulari esistenti nei tessuti reali. Gli organoidi 3D offrono opportunità uniche per studiare le funzioni dei ritmi circadiani nei sistemi multicellulari in vitro. Ad esempio, si potrebbero studiare i ritmi circadiani negli organoidi con composizioni cellulari alterate o organoidi derivati da tessuti malati dei pazienti. Questo protocollo consente l'utilizzo di un saggio di bioluminescenza per studiare diversi aspetti dei ritmi circadiani in un modello in vitro fisiologicamente più rilevante, gli organoidi, che ci aiuterà a comprendere meglio i ruoli dei ritmi circadiani negli organi periferici.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano tessuti umani per la generazione di HIE sono stati approvati da un IRB presso il CCHMC (IRB#2014-0427). Consulta la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo.

NOTA: Per illustrare la procedura descritta in questo protocollo, abbiamo utilizzato enteroidi intestinali umani (HIE) Bmal1-luc . Questi enteroidi sono stati sottoposti a trasduzione lentivirale stabile²² con il plasmide reporter pABpuro-BluF, che contiene il promotore Bmal1 fuso con la luciferasi, mostrando l'attività del promotore Bmal1 ²¹.

1. Trasduzione lentivirale

1. Effettuare la trasduzione lentivirale²² in condizioni arricchite con cellule staminali per HIE. In particolare, garantire la formazione di sferoidi negli HIE entro 3-4 giorni dal passaggio nei mezzi di crescita intestinale, che crea condizioni arricchite di cellule staminali.
2. Dopo la trasduzione lentivirale²², effettuare la selezione antibiotica con 2 μg/mL di puromicina, recuperare gli HIE resistenti alla puromicina e farli passare con una densità relativamente alta (cioè 1 pozzetto in 2 pozzetti) per 2-3x. Se il tasso di crescita degli HIE è lento, aggiungere 10 μM di inibitori ROCK (Y-27632) e 10 μM di inibitore GSK-3 (CHIR-99021) al terreno di crescita dell'organoide intestinale.

2. Preparazione di organoidi per saggi di bioluminescenza

1. Giorno 1: Passaggio HIE a piatti rotondi da 35 mm.
   1. In breve, per l'espansione degli HIE, mescolare gli HIE con la matrice di coltura 3D a fattore di crescita ridotto (GFR) e seminarli su piastre a 24 pozzetti con tre goccioline da 10 μL di matrice di coltura 3D per pozzetto. Aggiungere 350 μl di terreno di coltura HIE e sostituirlo a giorni alterni.
      NOTA: La densità di HIE nella matrice di coltura 3D è fondamentale per la crescita degli enteroidi. Approssimativamente, il numero di sferoidi dovrebbe superare più di 50 in ogni gocciolina. Se il numero è basso, il tasso di crescita dell'HIE è influenzato negativamente.
   2. Quando gli HIE crescono a sufficienza (circa 7 giorni dopo il post-passaggio), raccoglierli da quattro pozzetti in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
   3. Lavare gli HIE con il PBS freddo utilizzando una mini centrifuga da banco (2.000 × g) per una centrifuga rapida di 40 secondi per rimuovere i detriti e l'eccessiva matrice di coltura 3D mediante pipetta.
   4. Aggiungere 0,5 ml di PBS freddo nel pellet e applicare la turbolenza fisica siringando fino a 10 volte con una siringa da insulina da 1 ml per dissociare gli HIE.
   5. Centrifugare gli HIE dissociati con una mini centrifuga da banco come al punto 2.1.3 e rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta. Quindi, posizionare la provetta da microcentrifuga con il pellet HIE sul ghiaccio per farla raffreddare per circa 3 minuti.
   6. Aggiungere la matrice di coltura GFR 3D alla provetta della microcentrifuga e mescolarla con il pellet HIE.
      NOTA: Calcola la quantità della matrice di coltura 3D in base al numero di piatti rotondi da 35 mm che verranno utilizzati per l'esperimento. Generalmente seminiamo 30 μl di goccioline di matrice di coltura 3D per piatto rotondo.
   7. Seminare la miscela di HIE e la matrice di coltura 3D al centro della piastra rotonda da 35 mm e incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti per solidificare la matrice di coltura 3D.
      NOTA: La densità degli HIE di semina deve essere determinata sperimentalmente. Sulla base dell'intensità della bioluminescenza, è possibile determinare il numero di HIE durante questo processo.
   8. Aggiungere 2 mL di terreno di crescita organoide intestinale preriscaldato a ciascuna piastra e incubare le piastre in un incubatore di CO₂ fino alla fase successiva.
2. Giorno 3: Inizio della differenziazione
   1. Per avviare la differenziazione degli HIE, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato.
      NOTA: Vedere la Tabella 1 per le ricette dei mezzi di differenziazione HIE²³.
3. Giorno 4: Non è richiesto alcun processo aggiuntivo.
4. Giorno 5: Sostituire il terreno degli enteroidi con 2 mL di terreno di differenziazione preriscaldato.
5. Giorno 6: Sincronizzazione dell'orologio e registrazione della bioluminescenza
   1. Per sincronizzare l'orologio molecolare degli enteroidi, aggiungere 2 μL di 100 μM di desametasone (Dex) per ottenere la concentrazione finale di 100 nM in ciascuna piastra e quindi incubare le piastre in un incubatore di CO₂ (37 °C, 5% CO₂) per 1 ora^{e 24}.
   2. Durante il ripristino Dex, preparare il luminometro in incubazione. Controllare la CO₂ e la temperatura del luminometro in incubazione e impostarla rispettivamente al 5% e a 37 °C.
      NOTA: Si consiglia di pulire l'interno del luminometro in incubazione con alcol al 70% prima e dopo ogni utilizzo della macchina per mantenerla sterile.
   3. Dopo la sincronizzazione dell'orologio, ricaricare gli enteroidi con 3 mL di terreno di differenziazione preriscaldato contenente 200 μM di D-luciferina.
      NOTA: Poiché la luciferina è sensibile alla luce, il terreno contenente luciferina deve essere avvolto con un foglio e preriscaldato in un bagno di calore a 37 °C prima di applicarlo sul piatto.
   4. Posizionare le piastre in un tavolo a 8 pozzetti del luminometro in incubazione e coprire il tavolo della piastra campione con il coperchio. Posizionare due camere di umidificazione con fazzoletto umido o spugna sulla parte superiore del tavolo del piatto del campione. Si tratta di un processo una tantum.
      NOTA: Dopo l'inizio dell'esperimento, il coperchio del luminometro in incubazione deve essere tenuto chiuso fino al termine dell'esperimento. Assicurati di bagnare a sufficienza i fazzoletti/spugne.
   5. Chiudere il coperchio della macchina e avviare il programma per misurare la bioluminescenza per il numero di giorni e la risoluzione desiderati.
      1. Sul software, selezionare le impostazioni delle condizioni facendo clic sulla scheda Condizione e regolare le impostazioni su questo pannello: numero di piatti, tempo di misurazione, elaborazione in background e tipo di filtro.
         NOTA: Per questa dimostrazione, abbiamo selezionato tutte le parabole da A a H; tempo di misurazione predefinito, che è determinato dal software in base al numero di parabole; tempo di attesa per l'elaborazione in background e tipo di filtro F0. Poiché ci sono tre opzioni di filtro, tre colori luminescenti possono essere misurati contemporaneamente.
      2. Dopo aver immesso tutte le impostazioni appropriate in base all'esperimento, salvare le impostazioni facendo clic su OK.
      3. Per avviare l'esecuzione dell'esperimento, fare clic sulla scheda Esegui | Pulsante di avvio (icona a forma di triangolo verde). Osserva i dati come grezzi, filtrati dal rumore o detrendati effettuando le selezioni appropriate nella parte superiore dello schermo del software durante l'esecuzione degli esperimenti. Fare clic sulle schede Raw, Noise Filtered o Detrended per osservare i dati selezionati.
      4. Osservare i segnali per un massimo di 5 giorni.
         NOTA: Dopo 5 giorni di monitoraggio in un luminometro in incubazione, gli enteroidi possono iniziare a morire a causa dell'esaurimento del terreno. Per prevenire ogni possibile interruzione circadiana durante l'esperimento, non eseguiamo il cambio dei media per tutta la durata dell'esperimento.
      5. Al termine dell'esperimento, interrompi l'esecuzione facendo clic sul pulsante Interrompi (icona quadrata blu), vai alla scheda File e fai clic su Salva con nome. Salvare i dati in formato Kronos; esportare i dati in un foglio di calcolo nella sezione File facendo clic sull'opzione File e quindi selezionando Esporta in formato Excel sotto File per ulteriori analisi.

Risultati

La registrazione della bioluminescenza è stata condotta per valutare la ritmicità circadiana degli enteroidi intestinali umani (HIE) in due condizioni distinte: condizioni arricchite con cellule staminali utilizzando il terreno di crescita degli organoidi intestinali (Figura 3) rispetto alle condizioni che inducono la differenziazione, che è stata ottenuta sostituendo il mezzo di crescita degli organoidi intestinali con un mezzo di differenziazione. Il giorno dell'esperimento, abbiamo sin...

Discussione

Il saggio di bioluminescenza offre diversi vantaggi per lo studio dei ritmi circadiani, che richiede la raccolta di dati da esperimenti a lungo termine. In primo luogo, consente ai ricercatori di monitorare l'espressione genica o la proteina di interesse mentre le cellule si muovono e proliferano. Senza apportare modifiche inutili o interrompere le funzioni delle cellule, gli eventi cellulari interessati o l'espressione genica possono essere registrati utilizzando la lettura della bioluminescenza, che fornisce dati affid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor