Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Resumen

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Resumen

La mayoría de los organismos vivos poseen ritmos circadianos, que son procesos biológicos que ocurren en un período de aproximadamente 24 horas y regulan un repertorio diverso de procesos celulares y fisiológicos que van desde los ciclos de sueño-vigilia hasta el metabolismo. Este mecanismo de reloj arrastra al organismo en función de los cambios ambientales y coordina la regulación temporal de los eventos moleculares y fisiológicos. Anteriormente, se demostró que los ritmos circadianos autónomos se mantienen incluso a nivel de una sola célula utilizando líneas celulares como los fibroblastos NIH3T3, que fueron fundamentales para descubrir los mecanismos de los ritmos circadianos. Sin embargo, estas líneas celulares son cultivos homogéneos que carecen de multicelularidad y de comunicaciones intercelulares robustas. En la última década, se ha realizado un extenso trabajo en el desarrollo, caracterización y aplicación de organoides 3D, que son sistemas multicelulares in vitro que se asemejan a estructuras y funciones morfológicas in vivo . En este trabajo se describe un protocolo para la detección de ritmos circadianos utilizando un reportero bioluminiscente en enteroides, que permite la investigación de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares in vitro.

Introducción

Reloj circadiano
Todos los organismos, desde las bacterias hasta los mamíferos, tienen una relación compleja y dinámica con su entorno. Dentro de esta relación, la adaptación a los cambios ambientales es fundamental para la supervivencia de los organismos. La mayoría de los organismos poseen ritmos circadianos que les permiten adaptarse y optimizar sus funciones a ciclos diurnos de aproximadamente 24 h. El reloj circadiano es una red jerárquica de relojes centrales y periféricos que trabajan en cooperación para mantener la homeostasis fisiológica y mantener a los organismos sincronizados con los cambios diarios ^1,2. En los mamíferos, el reloj central o maestro ubicado en el núcleo supraquiasmático (SCN) recibe señales externas, como la luz, y transmite la información a los relojes periféricos a través de una interacción avanzada de vías de señalización neuronal y humoral³. Además del reloj central, los tejidos periféricos poseen su propio mecanismo de reloj circadiano autónomo de las células, mantenido por un bucle de retroalimentación negativa transcripcional-traduccional (TTFL) que regula los genes controlados por reloj específicos de tejido (CCG)^4,5. Esta maquinaria molecular produce aproximadamente 24 horas de ritmicidad en eventos celulares y fisiológicos, como expresiones génicas, vías de señalización, respuestas inmunes y digestión. El reloj circadiano está presente en casi todas las células de mamíferos, y se ha demostrado que hasta el 50% de los patrones de expresión de los genes exhiben ritmicidad circadiana⁶. Teniendo en cuenta la abundancia de CCG, la interrupción de este mecanismo de reloj puede dar lugar a problemas fisiológicos críticos. Por lo tanto, las investigaciones sobre los ritmos circadianos son necesarias para dilucidar los mecanismos biológicos esenciales y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

Sistema reportero de luciferasa
En los estudios circadianos, el monitoreo en tiempo real es fundamental para una mejor comprensión de los comportamientos y respuestas celulares, ya que permite rastrear los cambios temporales en la expresión génica y/o los niveles de proteínas, proporcionando información sobre los mecanismos moleculares regulados por el reloj circadiano. Además, el monitoreo en tiempo real permite a los investigadores estudiar los efectos de los cambios ambientales en los mecanismos moleculares ^7,8. Existen numerosas técnicas para los estudios de monitorización en tiempo real, incluido el ensayo de bioluminiscencia, que se utiliza ampliamente para rastrear la expresión génica o los niveles de proteínas a lo largo del tiempo. El ensayo de bioluminiscencia es un método para detectar procesos biológicos utilizando la producción de luz como lectura. En este ensayo, una enzima oxidativa que produce bioluminiscencia (por ejemplo, luciferasa) se transfecta de manera transitoria o estable en las células de interés, y la lectura de bioluminiscencia se mide en presencia de un sustrato (por ejemplo, luciferina) a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la enzima luciferasa produce bioluminiscencia oxidando el sustrato luciferina en presencia de ATP⁹. Debido a su corta vida media, 3-4 h¹⁰, la luciferasa de luciérnaga es una poderosa herramienta para los estudios circadianos en términos de proporcionar monitoreo dinámico en tiempo real con un ruido de fondo mínimo 11,12,13. Para la inserción de ADN con un promotor marcado con luciferasa o un marco de lectura abierto (ORF), el sistema de administración de genes lentivirales es un método confiable que proporciona una alta eficacia de transducción, una integración estable y una baja inmunogenicidad. La transducción estable de un reportero bioluminiscente proporciona una expresión robusta en células en división y no división, generando datos consistentes para estudios circadianos¹⁴.

Organoide como modelo
Las líneas celulares bidimensionales inmortalizadas tradicionales han sido fundamentales en estudios biológicos que van desde el descubrimiento de los mecanismos moleculares fundamentales de los ritmos circadianos hasta la detección de fármacos. A pesar de la conveniencia de utilizar líneas celulares homogeneizadas, carecen de estructuras multicelulares e interacciones intercelulares. Por el contrario, los organoides son estructuras multicelulares "similares a órganos" en 3D in vitro que imitan la estructura del órgano en una placa al mostrar similitud con la arquitectura de tejido in vivo y la multicelularidad, incluidos los tipos de células madre, progenitoras y diferenciadas^15,16. Poseer características de autoorganización, multicelularidad y funcionalidad hacen de los organoides un notable modelo in vitro que representa los procesos celulares y fisiológicos que ocurren en los tejidos reales¹⁷. Se pueden derivar diferentes tipos de organoides a partir de células madre pluripotentes a través de la diferenciación dirigida o células madre adultas recolectadas de varios órganos, incluidos el intestino delgado, el cerebro, el hígado, el pulmón y el riñón^18,19. Dado que las estructuras organoides poseen una arquitectura y función reales similares a las de los tejidos, con multicelularidad e interacción dinámica de célula a célula, son superiores a las líneas celulares homogeneizadas para comprender los eventos celulares que ocurren en los tejidos in vivo. Los organoides también son fácilmente manipulables y pueden cultivarse en condiciones controladas, lo que los hace útiles para los estudios circadianos²⁰.

El objetivo principal de este trabajo es presentar un método de monitorización en tiempo real utilizando un ensayo de bioluminiscencia específicamente diseñado para el estudio de los ritmos circadianos en organoides 3D multicelulares. El monitoreo en tiempo real de eventos celulares utilizando una técnica de ensayo de bioluminiscencia se ha realizado ampliamente para cultivos celulares que carecen de la complejidad multicelular y las comunicaciones intercelulares que existen en los tejidos reales. Los organoides 3D presentan oportunidades únicas para investigar las funciones de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares in vitro. Por ejemplo, se podrían investigar los ritmos circadianos en los organoides con composiciones celulares alteradas u organoides derivados de los tejidos enfermos de los pacientes. Este protocolo permite la utilización de un ensayo de bioluminiscencia para investigar diferentes aspectos de los ritmos circadianos en un modelo in vitro más relevante fisiológicamente , los organoides, que nos ayudará a comprender mejor el papel de los ritmos circadianos en los órganos periféricos.

Protocolo

Todos los experimentos que utilizaron tejidos humanos para la generación de HIEs fueron aprobados por un IRB en CCHMC (IRB # 2014-0427). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales utilizados en este protocolo.

NOTA: Para ilustrar el procedimiento descrito en este protocolo, utilizamos enteroides intestinales humanos (HIE) Bmal1-luc . Estos enteroides se sometieron a una transducción lentiviral estable²² con el plásmido reportero pABpuro-BluF, que contiene el promotor Bmal1 fusionado con luciferasa, mostrando la actividad del promotor Bmal1 ²¹.

1. Transducción lentiviral

1. Llevar a cabo la transducción lentiviral²² en condiciones enriquecidas con células madre para HIEs. Específicamente, asegure la formación de esferoides en los HIE dentro de los 3-4 días posteriores al paso en el medio de crecimiento intestinal, lo que crea condiciones enriquecidas con células madre.
2. Después de la transducción lentiviral²², realizar la selección de antibióticos con 2 μg/mL de puromicina, recuperar los HIEs resistentes a la puromicina y pasarlos con una densidad relativamente alta (es decir, 1 pozo a 2 pocillos) durante 2-3 veces. Si la tasa de crecimiento de los HIE es lenta, agregue 10 μM de inhibidores de ROCK (Y-27632) y 10 μM de inhibidor de GSK-3 (CHIR-99021) al medio de crecimiento de organoides intestinales.

2. Preparación de organoides para el ensayo de bioluminiscencia

1. Día 1: Paso de los HIE a platos redondos de 35 mm.
   1. Brevemente, para la expansión de los HIE, mezcle los HIE con una matriz de cultivo 3D reducida por factor de crecimiento (GFR) y siembrórelos en placas de 24 pocillos con tres gotas de 10 μL de matriz de cultivo 3D por pocillo. Agregue 350 μL del medio de crecimiento HIE y cámbielo cada dos días.
      NOTA: La densidad de HIE en la matriz de cultivo 3D es crítica para el crecimiento de enteroides. Aproximadamente, el número de esferoides debe superar más de 50 en cada gota. Si el número es bajo, la tasa de crecimiento del HIE se ve afectada negativamente.
   2. Cuando los HIE crezcan lo suficiente (aproximadamente 7 días después del post-paso), recoja los HIE de cuatro pocillos en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Lave los HIE con el PBS frío utilizando una minicentrífuga de sobremesa (2.000 × g) durante un centrifugado rápido de 40 s para eliminar los residuos y el exceso de matriz de cultivo 3D con pipeta.
   4. Agregue 0,5 mL de PBS frío en el pellet y aplique turbulencia física mediante una jeringa de hasta 10 mL con una jeringa de insulina de 1 mL para disociar los HIE.
   5. Gire los HIE disociados con una mini centrífuga de sobremesa como en el paso 2.1.3 y retire suavemente el sobrenadante con una pipeta. Luego, coloque el tubo de microcentrífuga con el pellet HIE en hielo para que se enfríe durante aproximadamente 3 minutos.
   6. Añada la matriz de cultivo GFR 3D al tubo de microcentrífuga y mézclela con el pellet HIE.
      NOTA: Calcule la cantidad de la matriz de cultivo 3D en función del número de platos redondos de 35 mm que se utilizarán para el experimento. Por lo general, sembramos 30 μL de gotas de matriz de cultivo 3D por plato redondo.
   7. Siembre la mezcla de HIEs y la matriz de cultivo 3D en el centro del plato redondo de 35 mm e incube el plato a 37 °C durante 20 min para solidificar la matriz de cultivo 3D.
      NOTA: La densidad de los HIE de siembra debe determinarse experimentalmente. En función de la intensidad de la bioluminiscencia, se puede determinar el número de HIE durante este proceso.
   8. Agregue 2 mL de medio de crecimiento de organoides intestinales precalentado a cada placa e incube las placas en una incubadora de_CO2 hasta el siguiente paso.
2. Día 3: Inicio de la diferenciación
   1. Para iniciar la diferenciación de los HIE, retire el medio de crecimiento y agregue 2 mL de medio de diferenciación precalentado.
      NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas del medio de diferenciación HIE²³.
3. Día 4: No se requiere ningún proceso adicional.
4. Día 5: Reemplace el medio de los enteroides con 2 mL de medio de diferenciación precalentado.
5. Día 6: Sincronización del reloj y registro de la bioluminiscencia
   1. Para sincronizar el reloj molecular de los enteroides, agregue 2 μL de dexametasona (Dex) de 100 μM para hacer la concentración final de 100 nM en cada placa y luego incube las placas en una incubadora de CO₂ (37 °C, 5% CO₂) durante 1 h²⁴.
   2. Durante el restablecimiento de Dex, prepare el luminómetro de incubación. Compruebe el_CO2 y la temperatura del luminómetro de incubación y ajústelo al 5% y a 37 °C, respectivamente.
      NOTA: Se sugiere limpiar el interior del luminómetro de incubación con alcohol al 70% antes y después de cada uso de la máquina para mantenerlo estéril.
   3. Después de la sincronización del reloj, reponga los enteroides con 3 mL de medio de diferenciación precalentado que contenga 200 μM de D-luciferina.
      NOTA: Como la luciferina es sensible a la luz, el medio que contiene luciferina debe envolverse con papel de aluminio y precalentarse en un baño de calor a 37 °C antes de aplicarlo al plato.
   4. Coloque los platos en una mesa de 8 pocillos del luminómetro de incubación y cubra la mesa de platos de muestra con su tapa. Coloque dos cámaras humidificadoras con pañuelo húmedo o esponja en la parte superior de la mesa de platos de muestra. Este es un proceso de una sola vez.
      NOTA: Una vez iniciado el experimento, la tapa del luminómetro de incubación debe mantenerse cerrada hasta que finalice el experimento. Asegúrate de mojar los pañuelos/esponjas lo suficiente.
   5. Cierre la tapa de la máquina e inicie el programa para medir la bioluminiscencia durante el número de días y la resolución deseados.
      1. En el software, seleccione la configuración de condiciones haciendo clic en la pestaña Condición y ajuste la configuración en este panel: número de platos, tiempo de medición, procesamiento en segundo plano y tipo de filtro.
         NOTA: Para esta demostración, seleccionamos todos los platos de la A a la H; tiempo de medición predeterminado, que es determinado por el software en función del número de platos; tiempo de espera para el procesamiento en segundo plano y el tipo de filtro F0. Dado que hay tres opciones de filtro, se pueden medir tres colores luminiscentes simultáneamente.
      2. Después de introducir todos los ajustes adecuados basados en el experimento, guarde los ajustes haciendo clic en Aceptar.
      3. Para iniciar la ejecución del experimento, haga clic en la pestaña Ejecutar | Botón de inicio (icono de triángulo verde). Observe los datos sin procesar, filtrados por ruido o sin tendencia realizando las selecciones adecuadas en la parte superior de la pantalla del software mientras ejecuta experimentos. Haga clic en las pestañas Sin procesar, Filtrado de ruido o Sin tendencia para observar los datos seleccionados.
      4. Observe las señales durante un máximo de 5 días.
         NOTA: Después de 5 días de monitoreo en un luminómetro de incubación, los enteroides pueden comenzar a morir debido al agotamiento del medio. Para evitar cualquier posible interrupción circadiana durante el experimento, no realizamos cambios de medios durante la duración del experimento.
      5. Al final del experimento, detenga la ejecución haciendo clic en el botón Detener (icono cuadrado azul), vaya a la pestaña Archivo y haga clic en Guardar como. Guarde los datos en el formato Kronos; exporte los datos a una hoja de cálculo en la sección Archivo haciendo clic en la opción Archivo y, a continuación, seleccionando Exportar como formato de Excel en el Archivo para un análisis más detallado.

Resultados

El registro de la bioluminiscencia se llevó a cabo para evaluar la ritmicidad circadiana de los enteroides intestinales humanos (HIE) en dos condiciones distintas: condiciones enriquecidas con células madre utilizando un medio de crecimiento de organoides intestinales (Figura 3) frente a condiciones inductoras de diferenciación, que se lograron reemplazando el medio de crecimiento del organoide intestinal por un medio de diferenciación. El día del experimento, sincronizamos los relojes ...

Discusión

El ensayo de bioluminiscencia ofrece varias ventajas para la investigación de los ritmos circadianos, que requiere la recopilación de datos de experimentos a largo plazo en el tiempo. En primer lugar, permite a los investigadores controlar la expresión génica o la proteína de interés a medida que las células se mueven y proliferan. Sin realizar ajustes innecesarios ni interrumpir las funciones de las células, los eventos celulares interesados o la expresión génica se pueden registrar mediante la lectura de biol...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor