Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Resumen

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Resumen

La mayoría de los organismos vivos poseen ritmos circadianos, que son procesos biológicos que ocurren en un período de aproximadamente 24 horas y regulan un repertorio diverso de procesos celulares y fisiológicos que van desde los ciclos de sueño-vigilia hasta el metabolismo. Este mecanismo de reloj arrastra al organismo en función de los cambios ambientales y coordina la regulación temporal de los eventos moleculares y fisiológicos. Anteriormente, se demostró que los ritmos circadianos autónomos se mantienen incluso a nivel de una sola célula utilizando líneas celulares como los fibroblastos NIH3T3, que fueron fundamentales para descubrir los mecanismos de los ritmos circadianos. Sin embargo, estas líneas celulares son cultivos homogéneos que carecen de multicelularidad y de comunicaciones intercelulares robustas. En la última década, se ha realizado un extenso trabajo en el desarrollo, caracterización y aplicación de organoides 3D, que son sistemas multicelulares in vitro que se asemejan a estructuras y funciones morfológicas in vivo . En este trabajo se describe un protocolo para la detección de ritmos circadianos utilizando un reportero bioluminiscente en enteroides, que permite la investigación de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares in vitro.

Introducción

Reloj circadiano
Todos los organismos, desde las bacterias hasta los mamíferos, tienen una relación compleja y dinámica con su entorno. Dentro de esta relación, la adaptación a los cambios ambientales es fundamental para la supervivencia de los organismos. La mayoría de los organismos poseen ritmos circadianos que les permiten adaptarse y optimizar sus funciones a ciclos diurnos de aproximadamente 24 h. El reloj circadiano es una red jerárquica de relojes centrales y periféricos que trabajan en cooperación para mantener la homeostasis fisiológica y mantener a los organismos sincronizados con los cambios diarios ^1,2

Protocolo

Todos los experimentos que utilizaron tejidos humanos para la generación de HIEs fueron aprobados por un IRB en CCHMC (IRB # 2014-0427). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales utilizados en este protocolo.

NOTA: Para ilustrar el procedimiento descrito en este protocolo, utilizamos enteroides intestinales humanos (HIE) Bmal1-luc . Estos enteroides se sometieron a una transducción lentiviral estable²² con el plásmido reportero pABpuro-BluF, que contiene el promotor Bmal1 fusionado con luciferasa, mostrando la actividad del promotor Bmal1....

Discusión

El ensayo de bioluminiscencia ofrece varias ventajas para la investigación de los ritmos circadianos, que requiere la recopilación de datos de experimentos a largo plazo en el tiempo. En primer lugar, permite a los investigadores controlar la expresión génica o la proteína de interés a medida que las células se mueven y proliferan. Sin realizar ajustes innecesarios ni interrumpir las funciones de las células, los eventos celulares interesados o la expresión génica se pueden registrar mediante la lectura de biol.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor