Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Zusammenfassung

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Zusammenfassung

Die meisten lebenden Organismen besitzen zirkadiane Rhythmen, d. h. biologische Prozesse, die innerhalb eines Zeitraums von etwa 24 Stunden ablaufen und ein vielfältiges Repertoire an zellulären und physiologischen Prozessen regulieren, die vom Schlaf-Wach-Rhythmus bis zum Stoffwechsel reichen. Dieser Uhrmechanismus zieht den Organismus auf der Grundlage von Umweltveränderungen mit und koordiniert die zeitliche Regulation molekularer und physiologischer Ereignisse. Zuvor wurde gezeigt, dass autonome zirkadiane Rhythmen auch auf Einzelzellebene aufrechterhalten werden, indem Zelllinien wie NIH3T3-Fibroblasten verwendet werden, die maßgeblich an der Aufdeckung der Mechanismen des zirkadianen Rhythmus beteiligt waren. Bei diesen Zelllinien handelt es sich jedoch um homogene Kulturen, denen es an Vielzelligkeit und robuster interzellulärer Kommunikation mangelt. In den letzten zehn Jahren wurden umfangreiche Arbeiten zur Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung von 3D-Organoiden durchgeführt, bei denen es sich um in vitro multizelluläre Systeme handelt, die in vivo morphologischen Strukturen und Funktionen ähneln. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Detektion zirkadianer Rhythmen mit Hilfe eines biolumineszierenden Reporters in humanen intestinalen Enteroiden beschrieben, das die Untersuchung zirkadianer Rhythmen in multizellulären Systemen in vitro ermöglicht.

Einleitung

Zirkadiane Uhr
Alle Organismen, von Bakterien bis zu Säugetieren, haben eine komplexe und dynamische Beziehung zu ihrer Umwelt. Innerhalb dieser Beziehung ist die Anpassung an Umweltveränderungen entscheidend für das Überleben von Organismen. Die meisten Organismen verfügen über zirkadiane Rhythmen, die es ihnen ermöglichen, sich an Tageszyklen von etwa 24 Stunden anzupassen und ihre Funktionen zu optimieren. Die zirkadiane Uhr ist ein hierarchisches Netzwerk aus zentralen und peripheren Uhren, die zusammenarbeiten, um die physiologische Homöostase aufrechtzuerhalten und den Organismus mit den täglichen Veränderungen synchron zu halten

Protokoll

Alle Experimente mit humanem Gewebe zur Erzeugung von HIEs wurden von einem IRB am CCHMC genehmigt (IRB#2014-0427). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

HINWEIS: Um das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren zu veranschaulichen, haben wir Bmal1-luc humane Darmenteroide (HIEs) verwendet. Diese Enteroide durchliefen eine stabile lentivirale Transduktion²² mit dem pABpuro-BluF-Reporterplasmid, das den mit Luciferase fusionierten Bmal1-Promotor enthält, was die Aktivität des Bmal1-Promotors ^2....

Diskussion

Der Biolumineszenz-Assay bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus, was eine Datenerhebung aus Langzeit-Zeitverlaufsexperimenten erfordert. Erstens ermöglicht es Forschern, die Genexpression oder das Protein von Interesse zu überwachen, während sich Zellen bewegen und vermehren. Ohne unnötige Anpassungen vorzunehmen oder die Zellfunktionen zu stören, können interessierte zelluläre Ereignisse oder die Genexpression mithilfe der Biolumineszenzauslesung aufgezeichnet werden, die zuverläs.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor