Überwachung zirkadianer Oszillationen mit einem Biolumineszenz-Reporter in Organoiden

Zusammenfassung

Zirkadiane Rhythmen, die in den meisten Organismen vorkommen, regulieren die zeitliche Organisation biologischer Prozesse. 3D-Organoide haben sich in jüngster Zeit als physiologisch relevantes In-vitro-Modell herauskristallisiert. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von biolumineszierenden Reportern zur Beobachtung zirkadianer Rhythmen in Organoiden, was in vitro Untersuchungen von zirkadianen Rhythmen in multizellulären Systemen ermöglicht.

Zusammenfassung

Die meisten lebenden Organismen besitzen zirkadiane Rhythmen, d. h. biologische Prozesse, die innerhalb eines Zeitraums von etwa 24 Stunden ablaufen und ein vielfältiges Repertoire an zellulären und physiologischen Prozessen regulieren, die vom Schlaf-Wach-Rhythmus bis zum Stoffwechsel reichen. Dieser Uhrmechanismus zieht den Organismus auf der Grundlage von Umweltveränderungen mit und koordiniert die zeitliche Regulation molekularer und physiologischer Ereignisse. Zuvor wurde gezeigt, dass autonome zirkadiane Rhythmen auch auf Einzelzellebene aufrechterhalten werden, indem Zelllinien wie NIH3T3-Fibroblasten verwendet werden, die maßgeblich an der Aufdeckung der Mechanismen des zirkadianen Rhythmus beteiligt waren. Bei diesen Zelllinien handelt es sich jedoch um homogene Kulturen, denen es an Vielzelligkeit und robuster interzellulärer Kommunikation mangelt. In den letzten zehn Jahren wurden umfangreiche Arbeiten zur Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung von 3D-Organoiden durchgeführt, bei denen es sich um in vitro multizelluläre Systeme handelt, die in vivo morphologischen Strukturen und Funktionen ähneln. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Detektion zirkadianer Rhythmen mit Hilfe eines biolumineszierenden Reporters in humanen intestinalen Enteroiden beschrieben, das die Untersuchung zirkadianer Rhythmen in multizellulären Systemen in vitro ermöglicht.

Einleitung

Zirkadiane Uhr
Alle Organismen, von Bakterien bis zu Säugetieren, haben eine komplexe und dynamische Beziehung zu ihrer Umwelt. Innerhalb dieser Beziehung ist die Anpassung an Umweltveränderungen entscheidend für das Überleben von Organismen. Die meisten Organismen verfügen über zirkadiane Rhythmen, die es ihnen ermöglichen, sich an Tageszyklen von etwa 24 Stunden anzupassen und ihre Funktionen zu optimieren. Die zirkadiane Uhr ist ein hierarchisches Netzwerk aus zentralen und peripheren Uhren, die zusammenarbeiten, um die physiologische Homöostase aufrechtzuerhalten und den Organismus mit den täglichen Veränderungen synchron zu halten ^1,2. Bei Säugetieren empfängt die Zentral- oder Hauptuhr im suprachiasmatischen Kern (SCN) externe Signale wie Licht und leitet die Informationen über ein fortschrittliches Zusammenspiel von neuronalen und humoralen Signalwegen an die peripheren Uhren^{weiter 3}. Zusätzlich zur zentralen Uhr verfügen periphere Gewebe über einen eigenen zellautonomen zirkadianen Uhrmechanismus, der durch eine transkriptionell-translationale negative Rückkopplungsschleife (TTFL) aufrechterhalten wird, die gewebespezifische uhrgesteuerte Gene (CCGs^{) reguliert4,5}. Diese molekulare Maschinerie erzeugt eine Rhythmizität von etwa 24 Stunden bei zellulären und physiologischen Ereignissen, wie z. B. Genexpressionen, Signalwegen, Immunantworten und Verdauung. Die zirkadiane Uhr ist in fast allen Säugetierzellen vorhanden, und es wurde gezeigt, dass bis zu 50 % der Expressionsmuster der Gene eine zirkadiane Rhythmizität aufweisen⁶. In Anbetracht der Fülle an CCGs kann eine Störung dieses Uhrwerks zu kritischen physiologischen Problemen führen. Daher sind Untersuchungen des zirkadianen Rhythmus notwendig, um wesentliche biologische Mechanismen aufzuklären und neue therapeutische Strategien zu entwickeln.

Luziferase-Reportersystem
In zirkadianen Studien ist die Echtzeitüberwachung entscheidend für ein besseres Verständnis zellulärer Verhaltensweisen und Reaktionen, da sie die Verfolgung zeitlicher Veränderungen der Genexpression und/oder des Proteinspiegels ermöglicht und Einblicke in die molekularen Mechanismen liefert, die von der zirkadianen Uhr reguliert werden. Darüber hinaus ermöglicht die Echtzeitüberwachung den Forschern, die Auswirkungen von Umweltveränderungen auf molekulare Mechanismen zu untersuchen ^7,8. Es gibt zahlreiche Techniken für Echtzeit-Überwachungsstudien, einschließlich des Biolumineszenz-Assays, der häufig zur Verfolgung der Genexpression oder des Proteinspiegels im Laufe der Zeit verwendet wird. Der Biolumineszenz-Assay ist eine Methode zum Nachweis biologischer Prozesse unter Verwendung der Lichterzeugung als Auslese. In diesem Assay wird ein oxidatives Enzym, das Biolumineszenz erzeugt (z. B. Luciferase), entweder vorübergehend oder stabil in die interessierenden Zellen transfiziert, und die Biolumineszenzauslesung wird in Gegenwart eines Substrats (z. B. Luciferin) über die Zeit gemessen. Zum Beispiel erzeugt das Luciferase-Enzym Biolumineszenz, indem es das Substrat Luciferin in Gegenwart von ATP⁹ oxidiert. Aufgrund ihrer kurzen Halbwertszeit von 3-4 h¹⁰ ist die Glühwürmchen-Luziferase ein leistungsstarkes Werkzeug für zirkadiane Studien, da sie eine dynamische Echtzeitüberwachung mit minimalem Hintergrundrauschen ermöglicht 11,12,13. Für die Insertion von DNA mit einem Luciferase-markierten Promotor oder Open Reading Frame (ORF) ist das lentivirale Gen-Delivery-System eine zuverlässige Methode, die eine hohe Transduktionswirksamkeit, eine stabile Integration und eine geringe Immunogenität bietet. Die stabile Transduktion eines biolumineszenten Reporters sorgt für eine robuste Expression in sich teilenden und nicht teilenden Zellen und liefert konsistente Daten für zirkadiane Studien¹⁴.

Organoid als Modell
Traditionelle immortalisierte zweidimensionale Zelllinien waren maßgeblich an biologischen Studien beteiligt, die von der Aufdeckung grundlegender molekularer Mechanismen des zirkadianen Rhythmus bis hin zum Wirkstoffscreening reichen. Trotz der Bequemlichkeit, homogenisierte Zelllinien zu verwenden, fehlen ihnen multizelluläre Strukturen und interzelluläre Interaktionen. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei Organoiden um multizelluläre "organähnliche" In-vitro-3D-Strukturen, die die Organstruktur in einer Schale nachahmen, indem sie Ähnlichkeit mit der in vivo-Gewebearchitektur und Vielzelligkeit aufweisen, einschließlich Stamm-, Vorläufer- und differenzierten Zelltypen^15,16. Der Besitz von Selbstorganisation, Vielzelligkeit und Funktionalität macht Organoide zu einem bemerkenswerten In-vitro-Modell, das die zellulären und physiologischen Prozesse darstellt, die in realen Geweben ablaufen¹⁷. Verschiedene Arten von Organoiden können aus pluripotenten Stammzellen durch gerichtete Differenzierung oder adulten Stammzellen gewonnen werden, die aus verschiedenen Organen, einschließlich Dünndarm, Gehirn, Leber, Lunge und Niere entnommen werden,^18,19. Da organoide Strukturen eine echte gewebeähnliche Architektur besitzen und mit Vielzelligkeit und dynamischer Zell-zu-Zell-Interaktion funktionieren, sind sie homogenisierten Zelllinien überlegen, um die zellulären Ereignisse in in vivo-Geweben zu verstehen. Organoide sind außerdem leicht zu manipulieren und können unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet werden, was sie für zirkadiane Studien nützlich macht²⁰.

Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Einführung einer Echtzeit-Überwachungsmethode unter Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, der speziell auf die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus in multizellulären 3D-Organoiden zugeschnitten ist. Die Echtzeitüberwachung zellulärer Ereignisse mit einer Biolumineszenz-Assay-Technik wurde häufig für Zellkulturen durchgeführt, denen die multizelluläre Komplexität und interzelluläre Kommunikation fehlt, die in echtem Gewebe vorhanden sind. 3D-Organoide bieten einzigartige Möglichkeiten, die Funktionen des zirkadianen Rhythmus in multizellulären Systemen in vitro zu untersuchen. Man könnte zum Beispiel zirkadiane Rhythmen in den Organoiden mit veränderten Zellzusammensetzungen oder Organoiden untersuchen, die aus erkranktem Gewebe von Patienten stammen. Dieses Protokoll ermöglicht die Verwendung eines Biolumineszenz-Assays, um verschiedene Aspekte des zirkadianen Rhythmus in einem physiologisch relevanteren In-vitro-Modell , Organoiden, zu untersuchen, was uns helfen wird, die Rolle des zirkadianen Rhythmus in peripheren Organen besser zu verstehen.

Protokoll

Alle Experimente mit humanem Gewebe zur Erzeugung von HIEs wurden von einem IRB am CCHMC genehmigt (IRB#2014-0427). In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

HINWEIS: Um das in diesem Protokoll beschriebene Verfahren zu veranschaulichen, haben wir Bmal1-luc humane Darmenteroide (HIEs) verwendet. Diese Enteroide durchliefen eine stabile lentivirale Transduktion²² mit dem pABpuro-BluF-Reporterplasmid, das den mit Luciferase fusionierten Bmal1-Promotor enthält, was die Aktivität des Bmal1-Promotors ²¹ zeigt.

1. Lentivirale Transduktion

1. Die lentivirale Transduktion²² wird unter stammzellangereicherten Bedingungen für HIEs durchgeführt. Stellen Sie insbesondere sicher, dass sich in HIEs innerhalb von 3-4 Tagen nach der Passage in das Darmwachstumsmedium Sphäroide bilden, wodurch stammzellangereicherte Bedingungen geschaffen werden.
2. Nach der lentiviralen Transduktion²² führt man eine Antibiotikaauswahl mit 2 μg/ml Puromycin durch, gewinnt die Puromycin-resistenten HIEs zurück und passaget sie mit relativ hoher Dichte (d. h. 1 Vertiefung in 2 Vertiefungen) für 2-3x. Wenn die Wachstumsrate der HIEs langsam ist, fügen Sie dem Darmorganoid-Wachstumsmedium 10 μM ROCK-Inhibitoren (Y-27632) und 10 μM GSK-3-Inhibitoren (CHIR-99021) hinzu.

2. Vorbereitung von Organoiden für den Biolumineszenz-Assay

1. Tag 1: Passage HIEs zu 35 mm runden Schalen.
   1. Kurz gesagt, zur Erweiterung der HIEs mischen Sie die HIEs mit einer wachstumsfaktorreduzierten (GFR) 3D-Kulturmatrix und säen Sie sie auf 24-Well-Platten mit drei Tröpfchen à 10 μl 3D-Kulturmatrix pro Well. Fügen Sie 350 μl des HIE-Wachstumsmediums hinzu und wechseln Sie es jeden zweiten Tag.
      HINWEIS: Die Dichte von HIE in der 3D-Kulturmatrix ist entscheidend für das Wachstum von Enteroiden. Ungefähr sollte die Anzahl der Sphäroide in jedem Tröpfchen mehr als 50 überschreiten. Ist die Zahl niedrig, wird die Wachstumsrate des HIE negativ beeinflusst.
   2. Wenn die HIEs ausreichend wachsen (ca. 7 Tage nach der Nachpassage), sammeln Sie HIEs aus vier Vertiefungen in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Waschen Sie die HIEs mit dem kalten PBS mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.000 × g) für 40 s schnelles Schleudern, um Schmutz und überschüssige 3D-Kulturmatrix per Pipette zu entfernen.
   4. Geben Sie 0,5 ml des kalten PBS in das Pellet und wenden Sie physikalische Turbulenzen an, indem Sie bis zu 10x mit einer 1-ml-Insulinspritze spritzen, um die HIEs zu dissoziieren.
   5. Schleudern Sie die dissoziierten HIEs mit einer Tisch-Minizentrifuge wie in Schritt 2.1.3 herunter und entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Legen Sie dann das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem HIE-Pellet auf Eis, um es ca. 3 Minuten lang abzukühlen.
   6. Geben Sie die GFR 3D-Kulturmatrix in das Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie sie mit dem HIE-Pellet.
      HINWEIS: Berechnen Sie die Menge der 3D-Kulturmatrix basierend auf der Anzahl der runden 35-mm-Schalen, die für das Experiment verwendet werden. In der Regel säen wir 30 μl 3D-Kulturmatrixtröpfchen pro runder Schale.
   7. Die Mischung aus HIEs und der 3D-Kulturmatrix in der Mitte der runden 35-mm-Schale aussäen und die Schale 20 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die 3D-Kulturmatrix zu verfestigen.
      HINWEIS: Die Dichte der Aussaat-HIEs sollte experimentell bestimmt werden. Anhand der Intensität der Biolumineszenz kann man die Anzahl der HIEs während dieses Prozesses bestimmen.
   8. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes Darmorganoid-Wachstumsmedium in jede Schale und inkubieren Sie die Schalen in einem CO₂ -Inkubator bis zum nächsten Schritt.
2. Tag 3: Initiierung der Differenzierung
   1. Um die Differenzierung der HIEs einzuleiten, entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 2 mL vorgewärmtes Differenzierungsmedium hinzu.
      HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Rezepturen des HIE-Differenzierungsmediums²³.
3. Tag 4: Es ist kein zusätzlicher Prozess erforderlich.
4. Tag 5: Ersetzen Sie das Medium der Enteroide durch 2 mL vorgewärmtes Differenzierungsmedium.
5. Tag 6: Uhrensynchronisation und Aufzeichnung der Biolumineszenz
   1. Um die molekulare Uhr der Enteroide zu synchronisieren, fügen Sie 2 μl 100 μM Dexamethason (Dex) hinzu, um die Endkonzentration in jeder Schale auf 100 nM zu erhöhen, und inkubieren Sie die Schalen dann in einem CO₂ -Inkubator (37 °C, 5% CO₂) für 1 h²⁴.
   2. Bereiten Sie während des Dex-Zurücksetzens das Inkubationsluminometer vor. Überprüfen Sie den CO_{2 -} Gehalt und die Temperatur des Inkubationsluminometers und stellen Sie es auf 5 % bzw. 37 °C ein.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, das Innere des Inkubationsluminometers vor und nach jedem Gebrauch der Maschine mit 70% Alkohol abzuwischen, um es steril zu halten.
   3. Nach der Taktsynchronisation füllen Sie die Enteroide mit 3 mL vorgewärmtem Differenzierungsmedium auf, das 200 μM D-Luciferin enthält.
      HINWEIS: Da Luciferin lichtempfindlich ist, sollte das luciferinhaltige Medium mit Folie umwickelt und in einem 37 °C heißen Bad vorgewärmt werden, bevor es auf das Gericht aufgetragen wird.
   4. Stellen Sie die Schalen in einen 8-Well-Schalentisch des Inkubationsluminometers und decken Sie den Probenschalentisch mit seinem Deckel ab. Stellen Sie zwei Befeuchterkammern mit einem feuchten Tuch oder Schwamm auf die Oberseite des Probentisches. Dies ist ein einmaliger Vorgang.
      HINWEIS: Nach dem Start des Experiments sollte der Deckel des Inkubationsluminometers geschlossen bleiben, bis das Experiment beendet ist. Achten Sie darauf, die Taschentücher/Schwämme ausreichend zu befeuchten.
   5. Schließen Sie den Deckel des Geräts und starten Sie das Programm zur Messung der Biolumineszenz für die gewünschte Anzahl von Tagen und die gewünschte Auflösung.
      1. Wählen Sie in der Software die Bedingungseinstellungen aus, indem Sie auf die Registerkarte Bedingung klicken, und passen Sie die Einstellungen in diesem Bereich an: Anzahl der Gerichte, Messzeit, Hintergrundverarbeitung und Filtertyp.
         HINWEIS: Für diese Demonstration haben wir alle Gerichte von A bis H ausgewählt; Standardmesszeit, die von der Software auf der Grundlage der Anzahl der Gerichte bestimmt wird; Wartezeit für die Hintergrundverarbeitung und Filtertyp F0. Da es drei Filteroptionen gibt, können drei Leuchtfarben gleichzeitig gemessen werden.
      2. Nachdem Sie alle geeigneten Einstellungen basierend auf dem Experiment eingegeben haben, speichern Sie die Einstellungen mit OK.
      3. Um mit dem Ausführen des Experiments zu beginnen, klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen | Start-Schaltfläche (grünes Dreieckssymbol). Beobachten Sie die Daten als roh, rauschgefiltert oder trendbereinigt, indem Sie während des Ausführens von Experimenten oben auf dem Bildschirm der Software eine entsprechende Auswahl treffen. Klicken Sie auf die Registerkarten Raw, Rauschgefiltert oder Trendbereinigt , um die ausgewählten Daten zu beobachten.
      4. Beobachten Sie Signale bis zu 5 Tage lang.
         HINWEIS: Nach 5-tägiger Überwachung in einem inkubierenden Luminometer können die Enteroide aufgrund von Medienerschöpfung abzusterben beginnen. Um eine mögliche zirkadiane Störung während des Experiments zu vermeiden, führen wir für die Dauer des Experiments keinen Medienwechsel durch.
      5. Beenden Sie am Ende des Experiments die Ausführung, indem Sie auf die Schaltfläche Stopp (blaues quadratisches Symbol) klicken, zur Registerkarte Datei wechseln und dann auf Speichern unter klicken. Speichern Sie die Daten im Kronos-Format. Exportieren Sie die Daten in eine Tabelle im Abschnitt Datei, indem Sie auf die Option Datei klicken und dann unter Datei zur weiteren Analyse die Option Als Excel-Format exportieren auswählen.

Ergebnisse

Es wurde eine Biolumineszenzaufzeichnung durchgeführt, um die zirkadiane Rhythmizität von humanen Darmenteroiden (HIEs) unter zwei unterschiedlichen Bedingungen zu beurteilen: stammzellangereicherte Bedingungen unter Verwendung von Darmorganoid-Wachstumsmedium (Abbildung 3) im Vergleich zu differenzierungsinduzierenden Bedingungen, die durch den Ersatz des Darmorganoid-Wachstumsmediums durch ein Differenzierungsmedium erreicht wurden. Am Tag des Experiments synchronisierten wir die zirkadi...

Diskussion

Der Biolumineszenz-Assay bietet mehrere Vorteile für die Untersuchung des zirkadianen Rhythmus, was eine Datenerhebung aus Langzeit-Zeitverlaufsexperimenten erfordert. Erstens ermöglicht es Forschern, die Genexpression oder das Protein von Interesse zu überwachen, während sich Zellen bewegen und vermehren. Ohne unnötige Anpassungen vorzunehmen oder die Zellfunktionen zu stören, können interessierte zelluläre Ereignisse oder die Genexpression mithilfe der Biolumineszenzauslesung aufgezeichnet werden, die zuverläs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor